滲透壓對于擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

張 寧，田錫煒，王永紅，儲 炬，張嗣良

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237）

乳酸廣泛應(yīng)用于食品、制藥、皮革、紡織工業(yè)以及化工原料方面，其最有前景的是用于合成可生物降解和具有生物相容性的聚合物，聚乳酸（PLA）[1]。基于乳酸在可持續(xù)資源方面的優(yōu)勢，越來越多的研究者將目光聚集在乳酸單體的生產(chǎn)上。近年來乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但是研究者們?nèi)灾铝τ趯で蠼?jīng)濟高效的發(fā)酵過程來生產(chǎn)乳酸[2-4]。

在影響乳酸發(fā)酵生產(chǎn)過程因素的研究報道中，底物及外界環(huán)境因素（如pH、通氣和攪拌等）被證明能夠影響乳酸菌的生長和乳酸生產(chǎn)。在多數(shù)有機酸發(fā)酵過程中，通常向發(fā)酵液中不斷補入堿性中和劑來調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH在合適的范圍，從而有利于菌體生長和生產(chǎn)。但是連續(xù)補入堿性中和劑會引起發(fā)酵液中環(huán)境滲透壓不斷升高，這嚴(yán)重影響菌體的生長及產(chǎn)酸[5]。環(huán)境滲透壓的增加往往會造成細(xì)胞生長速率和活性的降低并且影響細(xì)胞的代謝[6-10]。研究表明微生物本身具有多種滲透壓應(yīng)激響應(yīng)機制來保護(hù)或減輕細(xì)胞受到的影響，這些機制包括自身合成可溶性溶質(zhì)和滲透壓保護(hù)劑[11-12]、代謝流的重新分布[13]以及細(xì)胞膜特性的改變[14-15]。海藻糖、甜菜堿以及脯氨酸通常作為滲透壓保護(hù)劑，用于降低發(fā)酵過程中滲透應(yīng)激對細(xì)胞的影響。Andersson等[16]向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿來降低滲透應(yīng)激對細(xì)胞的影響，使得發(fā)酵時間縮短了約32h。Xu等[17]報道了向培養(yǎng)基中添加1g/L脯氨酸后，細(xì)胞生長和丙酮酸產(chǎn)率分別增加了59%和14.3%。Purvis等[18]驗證了大腸桿菌過量表達(dá)海藻糖能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。工業(yè)菌株擬干酪乳酸桿菌在高糖及向發(fā)酵液中不斷補入堿性中和劑的發(fā)酵情況下，觀察到這些因素所造成的高滲透壓對擬干酪乳桿菌生長及產(chǎn)酸產(chǎn)生了很強脅迫作用，為了降低滲透壓對發(fā)酵的影響，通過比較海藻糖、甜菜堿以及脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑，進(jìn)而選擇一種能夠在高糖及補加堿性中和劑的擬干酪乳桿菌發(fā)酵過程中有效改善環(huán)境滲透壓的保護(hù)劑，從而改善擬干酪乳桿菌工業(yè)菌株的發(fā)酵應(yīng)用。

本文研究了滲透壓對于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響，并篩選了一種滲透壓保護(hù)劑來增加菌體的葡萄糖消耗速率及L-乳酸的產(chǎn)率。此外，通過分析胞外副產(chǎn)物的變化，討論了滲透壓保護(hù)劑對于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬干酪乳酸桿菌 本實驗室保藏，保存方法為菌種種子液、水、甘油以1∶2∶1的比例保存于-80℃；葡萄糖 上海惠興生化試劑有限公司，分析純；蛋白胨 化學(xué)試劑采購供應(yīng)站，生化試劑；牛肉膏 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，生化試劑；酵母膏 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，生化試劑；其他試劑 來源于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

UV-VIS-752分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；SBA-40D生化分析儀 山東省科學(xué)院；5L玻璃發(fā)酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司；pH計 美國Mettler Toledo公司；分析天平 上海天平儀器；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司制造；FM-8P全自動冰點滲透壓計 上海醫(yī)大儀器廠；安捷倫1100HPLC 美國安捷倫科技。

1.2 培養(yǎng)基

茄子瓶斜面培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏6，酵母浸提物10，磷酸氫二鉀2，檸檬酸二胺2，乙酸鈉4，葡萄糖40，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，瓊脂18，吐溫-80 1m L，碳酸鈣10，NaOH調(diào)pH 6.0，115℃滅菌20m in。

搖瓶種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，氯化鈉0.03，硫酸亞鐵0.01，乙酸鈉4，檸檬酸二胺2，磷酸氫二鉀2，吐溫-80 1m L，碳酸鈣25，NaOH調(diào)pH 6.0，115℃滅菌20m in。葡萄糖（40g/L）單獨分開滅菌，115℃滅菌20m in。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨13.33，酵母膏13.33，硫酸鎂0.0133，硫酸錳0.0133，氯化鈉0.0133，硫酸亞鐵0.0133，醋酸鈉0.67，碳酸鈣40，NaOH調(diào)pH6.0，115℃滅菌2min。葡萄糖（90g/L）單獨分開滅菌，115℃滅菌20m in。

5 L罐培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨13.33，酵母膏13.33，硫酸鎂0.0133，硫酸錳0.0133，氯化鈉0.0133，硫酸亞鐵0.0133，醋酸鈉0.67。115℃滅菌20m in。葡萄糖（200g/L）單獨分開滅菌，115℃滅菌20m in。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 用水刮洗茄子平斜面后按15%的接種量接至搖瓶種子中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/m in，溫度為37℃。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)至對數(shù)期的搖瓶種子按20%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為100r/m in，溫度為37℃。

1.3.3 5L罐批培養(yǎng) 本實驗采用5L攪拌式反應(yīng)器進(jìn)行批培養(yǎng)發(fā)酵，工作體積為4L。轉(zhuǎn)速，通氣和溫度分別為150r/m in，0.025vvm和37℃，發(fā)酵過程中適用25%氨水控制發(fā)酵液pH 6.0，接種量為20%。

1.3.4 發(fā)酵上清液的制取 取10m L發(fā)酵液5000r/m in 10m in離心得上清，將上清稀釋到合適濃度，檢測前過濾上清液。濾液用于檢測滲透壓、葡萄糖、L-乳酸及副產(chǎn)物。

1.3.5 指標(biāo)的測定

1.3.5.1 生物量的測定 采用比濁法，在620nm處用紫外分光光度計測定。本文用OD620nm來表征細(xì)胞生物量。

1.3.5.2 發(fā)酵液中滲透壓、葡萄糖、L-乳酸及副產(chǎn)物的檢測 滲透壓：通過FM-8P Auto.F.P.滲透壓儀進(jìn)行檢測。

L-乳酸：通過SB-40C生物傳感分析儀進(jìn)行檢測。

葡萄糖：通過葡萄糖試劑盒進(jìn)行檢測。

胞外副產(chǎn)物：包括丙酮酸、甲酸、乙酸以及乙偶姻通過HPLC（安捷倫1100，美國安捷倫科技）進(jìn)行檢測。檢測條件：采用Metacarb H Plus柱（300mm×7.8mm；Varian Inc.，PaloA lto，CA，USA）進(jìn)行樣品分離。工作溫度為50℃，樣品用5mmol/L的H2SO4以0.4m L/m in進(jìn)行洗脫，并在210nm處UV檢測器儀進(jìn)行分析。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 滲透壓對于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響 向培養(yǎng)基中分別添加濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/L的NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，將細(xì)胞在含不同濃度的NaCl，初始葡萄糖為90g/L搖瓶內(nèi)37℃培養(yǎng)24h來研究滲透壓對L.paracasei生長及產(chǎn)酸的影響。發(fā)酵結(jié)束后通過測定乳酸量、殘?zhí)橇縼碛^察滲透壓對L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響。

1.4.2 滲透壓保護(hù)劑的選擇 向培養(yǎng)基中添加1mol/L的NaCl來產(chǎn)生一定的滲透壓，為了降低L.paracasei發(fā)酵過程中的滲透壓，實驗中比較了海藻糖、甜菜堿和脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑對乳酸發(fā)酵中滲透壓的影響。將菌體分別在初始葡萄糖濃度為90g/L左右、含指定濃度NaCl及指定濃度不同滲透壓保護(hù)劑的搖瓶內(nèi)37℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵結(jié)束后通過檢測乳酸、殘余葡萄糖、OD620nm來判斷最合適的滲透壓保護(hù)劑。

1.4.3 5L罐驗證脯氨酸對于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用 本實驗在5L攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行批發(fā)酵來驗證脯氨酸對細(xì)胞生長和乳酸生產(chǎn)的作用。通過比較菌體在初始葡萄糖濃度200g/L，37℃培養(yǎng)，發(fā)酵24h后添加和未添加脯氨酸情況下菌體生長、乳酸生產(chǎn)、葡萄糖消耗以及有機酸生產(chǎn)來驗證脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑的有效性。

1.5 計算公式

乳酸平均生產(chǎn)速率（g/（L·h））=乳酸生成量（g/L）/發(fā)酵時間（h）；

葡萄糖平均消耗率（g/（L·h））=葡萄糖消耗量（g/L）/發(fā)酵時間（h）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文中所有數(shù)據(jù)均取自三組平行實驗的平均值，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 滲透壓對于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響

本實驗采用NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑來研究滲透壓對L.paracasei生長及產(chǎn)酸的影響（圖1）。同樣的發(fā)酵條件下，菌體生物量、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗量隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的增加而迅速下降。乳酸產(chǎn)率從2.78g（/L·h）降至0.31g（/L·h），葡萄糖消耗率從2.47g（/L·h）降至0.08g（/L·h）。當(dāng)NaCl濃度從0增加到1mol/L時，雖然菌體生物量大大下降，幅度達(dá)到39.8%，但是乳酸量僅降低了12.2%。而當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度超過1mol/L時，細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成明顯被抑制了。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度為1.5mol/L時，細(xì)胞菌體及乳酸分別僅為NaCl 1mol/L時的53.9%和47.19%。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度為2mol/L時，細(xì)胞生長已經(jīng)終止，幾乎無乳酸產(chǎn)物形成。因此在接下來的實驗中，選擇1mol/L NaCl作為滲透壓保護(hù)劑的篩選條件進(jìn)行研究。

圖1 滲透壓對L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響Fig.1 Influence of the osmotic stress on L-lactic acid production by L.paracasei

2.2 滲透壓保護(hù)劑的選擇

滲透壓保護(hù)劑是一種小分子，它有助于保持膜的完整性和蛋白的穩(wěn)定性，從而保證細(xì)胞能夠在極端滲透壓下存活。微生物可自身合成滲透壓保護(hù)劑或者從培養(yǎng)基中攝取[19-20]。發(fā)酵過程中常用的滲透壓保護(hù)劑有海藻糖、甜菜堿和脯氨酸。為了降低L.paracasei發(fā)酵過程中的滲透壓，本文比較了海藻糖、甜菜堿和脯氨酸三種滲透壓保護(hù)劑對乳酸發(fā)酵中滲透壓的影響。實驗中通過向培養(yǎng)基中添加1mol/L的NaCl來產(chǎn)生一定的滲透壓（表1）。

表1 添加不同濃度滲透壓保護(hù)劑的發(fā)酵結(jié)果Table1 Fermentation resultswith different concentrations of osmoprotectants

從表1可以看出，發(fā)酵24h后，加入1mol/L NaCl的實驗組其細(xì)胞生長、乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗要明顯低于未加NaCl的對照組。同時滲透壓保護(hù)劑的加入能在一定程度上減輕對L.paracasei生長和生產(chǎn)的影響，特別是脯氨酸和海藻糖，其作用要明顯優(yōu)于甜菜堿。同時可以發(fā)現(xiàn)高濃度（10、20g/L）的甜菜堿對于L.paracasei生長和生產(chǎn)具有一定的抑制作用，這可能因為本身高濃度的甜菜堿也會產(chǎn)生一定程度的滲透壓，從而對細(xì)胞生長和代謝造成影響。綜合考慮菌體生長，乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗，在1mol/L的滲透應(yīng)激條件下，添加2g/L脯氨酸最有利于L.paracasei生長和生產(chǎn)，其發(fā)酵24h后，菌體生物量、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗速率分別為未添加脯氨酸實驗組的1.39、1.36、1.72倍。因此在接下來的實驗中，選擇2g/L脯氨酸作為滲透壓保護(hù)劑進(jìn)行研究。

2.3 5L罐驗證脯氨酸對于L.paracasei發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的作用

本實驗在5L攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行批發(fā)酵來驗證脯氨酸對細(xì)胞生長和乳酸生產(chǎn)的作用（圖2）。圖2為初始葡萄糖濃度200g/L，發(fā)酵24h后添加和未添加脯氨酸情況下菌體生長、乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗過程。

從圖2中可以看出，整個發(fā)酵過程可以根據(jù)產(chǎn)乳酸速率分為3個階段，分別為階段I（0～24h，產(chǎn)酸快速），階段II（24～35h，產(chǎn)酸較慢）和階段III（35～60h，產(chǎn)酸幾乎停滯）。因此選擇在24h后加入2g/L的脯氨酸，這是因為在此時產(chǎn)酸速率明顯減緩，同時在以前的實驗中發(fā)現(xiàn)此時發(fā)酵液中滲透壓與上面所述搖瓶中加入1mol/L NaCl后的初始培養(yǎng)基滲透壓較為接近（數(shù)據(jù)未顯示）。在階段Ⅰ，由于實驗組（24h加入脯氨酸）和對照組（24h未加脯氨酸）的發(fā)酵條件完全一致，因此菌體生長、產(chǎn)酸和耗糖都較為一致。當(dāng)進(jìn)入階段Ⅱ后，雖然菌體生物量沒有大的差異，但是添加了脯氨酸的實驗組菌體的產(chǎn)酸和耗糖與對照組相比發(fā)生了明顯變化。在階段Ⅲ中，兩組的產(chǎn)酸都幾乎停滯，而且耗糖速率也大大降低，這可能是由于滲透壓到達(dá)了一定的高度，此時脯氨酸對于細(xì)胞的保護(hù)作用也已經(jīng)大大減弱。

圖2 添加脯氨酸和未添加脯氨酸條件下，L.paracasei在5L罐中細(xì)胞生長，乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗對比Fig.2 Fermentation progresses of cell growth，L-lactic acid production and glucose consumption by L.paracasei in a 5L bioreactorwith orwithout proline addition

表2，可知階段Ⅱ中對照組與實驗組產(chǎn)酸及耗糖的差異，該階段實驗組的產(chǎn)酸速率為2.18g（/L·h），耗糖速率為3.56g（/L·h）；而對照組的產(chǎn)酸速率率為1.45g（/L·h），耗糖速率為2.55g（/L·h），分別增加了50.34%和39.61%。

表2 脯氨酸添加和未添加條件下，L.paracasei生理參數(shù)的比較（g/（L·h））Table2 Comparison of physiological parameters on L.paracasei with orwithout proline addition（g/（L·h））

此外，脯氨酸的加入對其他胞外副產(chǎn)物的形成也有影響。從表3中可以看出，發(fā)酵結(jié)束時實驗組中的丙酮酸、乙酸以及乙偶姻產(chǎn)量分別比對照組降低了42.3%、17.6%、38.8%，這可能是脯氨酸的加入有利于胞內(nèi)代謝流由副產(chǎn)物途徑流向乳酸途徑。

表3 脯氨酸添加和未添加條件下胞外副產(chǎn)物的比較Table3 Comparison of extracellular byproductswith or without proline addition

從以上實驗結(jié)果可以看出，脯氨酸能夠在一定范圍內(nèi)有效調(diào)控細(xì)胞對環(huán)境滲透壓的應(yīng)激響應(yīng)，有利于菌體的產(chǎn)酸和耗糖。

3 結(jié)論

本文研究了環(huán)境滲透壓對于L.paracasei生產(chǎn)L-乳酸的影響，結(jié)果表明菌體生長和代謝隨著環(huán)境滲透壓的增加受到顯著抑制。通過篩選三種滲透壓保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)2g/L脯氨酸能夠有效緩解高環(huán)境滲透壓對于菌體的抑制。在5L罐批培養(yǎng)過程中，隨著脯氨酸的加入，乳酸產(chǎn)率和耗糖率分別比未添加脯氨酸的對照組增加了50.34%和39.61%。同時胞外主要副產(chǎn)物的對比分析表明脯氨酸的添加能夠一定程度上改變代謝流由副產(chǎn)物途徑流向乳酸途徑。本文通過添加滲透壓保護(hù)劑提高了乳酸的生產(chǎn)，進(jìn)而也對于其他有機酸發(fā)酵具有重要的借鑒意義。

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