竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)食源性非酶糖基化的抑制

孫 濤，張亦鳴，謝 晶，薛 斌

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工儲(chǔ)藏工程研究中心，上海201306）

非酶糖基化反應(yīng)（NEG）又稱美拉德反應(yīng)，是氨基化合物蛋白質(zhì)、氨基酸與羰基化合物還原糖之間發(fā)生的一系列非酶促反應(yīng)，它會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而失去活性，生成不可逆的非酶糖基化末端產(chǎn)物（AGEs）[1]。NEG可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響脂質(zhì)代謝、修飾核酸及胞內(nèi)蛋白以及誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等，AGEs最終會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、白內(nèi)障、糖尿病腎病及其并發(fā)癥[2]。生物體自身新陳代謝會(huì)產(chǎn)生AGEs，而通過食物攝入是體內(nèi)積累AGEs的另一個(gè)重要來源[3]。通過抑制食品中的美拉德反應(yīng)來減少AGEs攝入和積累，對(duì)其引發(fā)的相關(guān)疾病的研究提供新思路。

某些抗氧化劑能明顯抑制蛋白質(zhì)糖基化[4]。黃酮在生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)非酶糖基化有抑制作用[5]。谷胱甘肽可減少腎組織糖基化終產(chǎn)物的生成，對(duì)糖尿病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用[6]，并抑制生理?xiàng)l件下糖基化產(chǎn)物的生成[7]。生理?xiàng)l件下抑制非酶糖基化而減少AGEs的積累是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而對(duì)食源性非酶糖基化抑制的研究較為罕見。

本文通過對(duì)果糖胺、二羰基化合物、小分子醛類物質(zhì)、熒光性終產(chǎn)物以及5-羥甲基糠醛（5-HMF）等不同階段糖基化產(chǎn)物的檢測(cè)，考察了竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)食源性非酶糖基化的抑制作用，以期為抑制食源性非酶糖基化的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

30%竹葉黃酮 食品級(jí)，購(gòu)自東莞金色盆地生物科技有限公司；98%谷胱甘肽 生物試劑，購(gòu)自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；氨基胍鹽酸鹽（aminoguanidine，AG）、5-羥甲基糠醛（5-HMF） 購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)有限公司；D-果糖（BR）、L-谷氨酸（BR）、磷酸二氫鈉（AR）、無水碳酸鈉（GR）、碳酸氫鈉（AR）、甲酸（AR）、甲酸鈉（AR）、Girard-T（吉拉爾特試劑，CP）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，BR）等 均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DELTA-320-S型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；WFZ UV 2000型紫外分光光度計(jì) 上海合利儀器有限公司；RF-530型PC熒光分光光度計(jì)日本島津公司；WatersTMAlliance 2695-2489型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食源性非酶糖基化體系的建立 0.04mol/L果糖與0.2mol/L谷氨酸溶于0.2mol/L pH=5.50的磷酸緩沖溶液中，置于沸水浴中回流加熱作為食源性非酶糖基化體系[8]，竹葉黃酮（0.01、0.1、1.0g/L）和谷胱甘肽（0.01、0.1、1.0g/L）分別為抑制劑，有糖基化反應(yīng)物，添加抑制劑的糖基化抑制組；只有糖基化反應(yīng)物，不添加抑制劑的糖基化反應(yīng)組；以及用磷酸鹽緩沖溶液代替糖基化體系且添加各濃度抑制劑的空白反應(yīng)組。同時(shí)，以1.0g/L氨基胍作為陽(yáng)性對(duì)照。將上述糖基化反應(yīng)體系于6、9、12h取樣，迅速冰水冷卻后，分別檢測(cè)其中的果糖胺、二羰基化合物、小分子醛類物質(zhì)、熒光產(chǎn)物以及5-HMF的含量，并計(jì)算抑制率。

1.2.2 NBT還原檢測(cè)果糖胺 將0.6m L糖基化產(chǎn)物和6.0m L 0.6mmol/L NBT置于0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（pH=10.35）中，于37℃水浴20m in[9]。用紫外-可見分光光度計(jì)于530nm處檢測(cè)吸光度。按下式計(jì)算糖基化反應(yīng)中對(duì)果糖胺的抑制率：

其中：Aa：不添加抑制劑糖基化反應(yīng)組的吸光度；Ab：添加糖基化反應(yīng)物，且添加抑制劑的糖基化抑制組的吸光度Ab′：不添加糖基化反應(yīng)物，只添加抑制劑的空白反應(yīng)組的吸光度。

1.2.3 Girard-T法檢測(cè)二羰基化合物 將0.5m L糖基化物質(zhì)和0.5m L 0.5mol/L Girard-T試劑置于7.0m L HCOOH-HCOONa緩沖溶液（pH=2.90）中，于30℃水浴中溫浴10m in[9]。用紫外-可見分光光度計(jì)于295nm處檢測(cè)吸光度。抑制率計(jì)算公式參照1.2.2。

1.2.4 紫外A295檢測(cè)小分子醛類 取糖基化物質(zhì)0.4m L，稀釋至10.0m L，用紫外-可見分光光度計(jì)于295nm處檢測(cè)吸光度[10]。抑制率計(jì)算公式參照1.2.2。1.2.5 熒光檢測(cè)終期蛋白質(zhì)交聯(lián)物質(zhì)AGEs 取糖基化物質(zhì)10.0m L，于激發(fā)波長(zhǎng)Ex=370nm和發(fā)射波長(zhǎng)Em=440nm處，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度[9]。

1.2.6 HPLC檢測(cè)5-HMF 色譜條件[11]：色譜柱：WatersTMAtlantis C18分析柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：超純水∶甲醇（90∶10）；流速：1.0m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：284nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，稀釋至40μg/m L，按上述方法過柱分離，作為定性依據(jù)。取t=6、9、12h的反應(yīng)液，過濾去除細(xì)微不溶性雜質(zhì)，進(jìn)行液相分析，檢測(cè)5-HMF。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，最終數(shù)據(jù)為三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值。兩組間比較采用t檢驗(yàn)（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)果糖胺的抑制

糖基化早期，果糖與谷氨酸的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，生成西弗堿，然后經(jīng)過環(huán)化、異構(gòu)化重排生成Amadori產(chǎn)物。Amadori產(chǎn)物之一的果糖胺是一種具有酮胺結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，在堿性條件下能還原NBT，形成藍(lán)紫色甲臜類化合物[12]，在530nm處有最大吸收峰[13]。所以檢測(cè)糖基化反應(yīng)物與NBT反應(yīng)后在可見光區(qū)域的吸光度可以判斷果糖胺的含量。表1為竹葉黃酮和谷胱甘肽對(duì)果糖胺的抑制效果。由此可知，竹葉黃酮對(duì)非酶糖基化初期生成的果糖胺有抑制作用，與生理?xiàng)l件下的糖基化研究結(jié)果相似[14]，且其抑制率基本隨抑制劑濃度增加而增加，1.0g/L竹葉黃酮反應(yīng)6h抑制效果最明顯，為52.13%。而谷胱甘肽對(duì)果糖胺的生成有促進(jìn)作用，濃度越大促進(jìn)效果越明顯。

表1 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)果糖胺的抑制（%）Table1 Inhibition effect of bamboo-leaf-flavonoids and glutathione on Fructosamine（%）

2.2 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)二羰基化合物的抑制

Amadori產(chǎn)物通過氧化、水解反應(yīng)降解成乙二醛、甲基乙二醛和脫氧葡萄糖醛酮等二羰基化合物。這些化合物比葡萄糖更容易與游離的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成糖基化終產(chǎn)物。據(jù)報(bào)道40%～50%的糖基化終產(chǎn)物來源于二羰基化合物[15]，Girard-T試劑在溫和的酸或堿性條件下可與含有二羰基基團(tuán)的醛或酮反應(yīng)，生成的加成化合物在紫外光下有較強(qiáng)吸收[10]。所以檢測(cè)糖基化反應(yīng)物與Girard-T反應(yīng)后紫外區(qū)的吸光度可以判斷二羰基化合物的含量。竹葉黃酮和谷胱甘肽對(duì)二羰基化合物的抑制情況見表2，可知兩者對(duì)二羰基化合物均有抑制作用，且抑制率都隨抑制劑濃度增加而增加。但兩組相比較而言，相同濃度下谷胱甘肽的抑制率比竹葉黃酮高。1.0g/L谷胱甘肽作為抑制劑，其12h抑制率可達(dá)到近90%，略低于1.0g/L氨基胍。

表2 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)二羰基化合物的抑制（%）Table2 Inhibition effect of bamboo-leaf-flavonoids and glutathione on dicarbonyl compound（%）

2.3 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)小分子醛類的抑制

糖基化中期，會(huì)生成無色小分子中間體，如：Amadori重排產(chǎn)物裂解的丙酮醛、丁二酮、丙酮醇等，以及它們?cè)赟trecker降解后小分子醛類，它們?cè)?95nm處有紫外吸收。紫外吸收值越高，糖基化反應(yīng)就越充分，由此可衡量糖基化反應(yīng)的進(jìn)程。竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)小分子醛的抑制見表3，谷胱甘肽在這一階段對(duì)糖基化反應(yīng)有明顯抑制作用，其抑制率隨濃度的增加而增加，0.01g/L與0.1g/L谷胱甘肽，其抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，1.0g/L谷胱甘肽，其抑制率基本不隨時(shí)間變化。0.1g/L與1.0g/L谷胱甘肽對(duì)小分子醛類物質(zhì)的抑制率遠(yuǎn)高于1.0g/L氨基胍。而竹葉黃酮對(duì)小分子醛類物質(zhì)的生成有促進(jìn)作用，其促進(jìn)率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，隨濃度增大而升高。

2.4 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)晚期AGEs的抑制

二羰基化合物繼續(xù)與游離的氨基作用，通過氧化、水解和環(huán)化反應(yīng)形成不可逆的熒光性終產(chǎn)物（AGEs）[15]。圖1為竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)熒光性終產(chǎn)物AGEs的影響，可知竹葉黃酮在這一階段對(duì)AGEs熒光強(qiáng)度有明顯的猝滅效果，1.0g/L竹葉黃酮，三個(gè)時(shí)間段內(nèi)的猝滅效果均優(yōu)于1.0g/L氨基胍。反應(yīng)12h，幾乎可完全猝滅，與生理?xiàng)l件下研究結(jié)果一致[5]。而谷胱甘肽對(duì)AGEs有部分促進(jìn)作用，促進(jìn)效果隨抑制劑的濃度增加而增加，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，0.01g/L與0.1g/L谷胱甘肽在反應(yīng)的9～12h逐漸抑制晚期AGEs，抑制效果隨濃度升高而降低，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而升高。

圖1 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)晚期AGEs的影響Fig.1 The influence effectof bamboo-leaf-flavonoids and glutathione on AGEs

2.5 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)5-HMF的抑制

目前，在酸催化條件下六碳糖脫水生成HMF的反應(yīng)機(jī)理并不十分清楚。一般認(rèn)為六碳糖在酸催化過程中第一步會(huì)生成烯醇互變結(jié)構(gòu)體這樣的中間產(chǎn)物，再進(jìn)一步脫水生成HMF，反應(yīng)過程主要經(jīng)歷異構(gòu)化、雙鍵斷裂和脫水這3個(gè)步驟（在以葡萄糖為反應(yīng)物時(shí)）[16]。

圖2為竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)5-HMF的影響，可知谷胱甘肽對(duì)5-HMF有明顯的抑制作用，且抑制效果隨谷胱甘肽濃度的增加而增加；1.0g/L谷胱甘肽作為抑制劑，在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)5-HMF的生成量幾乎不變。竹葉黃酮對(duì)5-HMF的生成有微弱的促進(jìn)作用。1g/L氨基胍作為抑制劑，HPLC沒有檢測(cè)出5-HMF，說明氨基胍?guī)缀蹩梢酝耆种?-HMF的生成。

圖2 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)5-HMF的影響Fig.2 The influence effectof bamboo-leaf-flavonoids and glutathione on 5-HMF

目前竹葉黃酮和谷胱甘肽對(duì)食源性非酶糖基化的抑制機(jī)理尚未明確。在本文實(shí)驗(yàn)條件下，竹葉黃酮與谷胱甘肽都不和果糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，其對(duì)非酶糖基化的抑制作用可能與它們的抗氧化性能有關(guān)，反應(yīng)前期和中期，糖基化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生較多活性自由基[17]，作為良好的抗氧化劑，竹葉黃酮和谷胱甘肽可以與這些自由基反應(yīng)，從而抑制糖基化反應(yīng)。竹葉黃酮和谷胱甘肽對(duì)晚期糖基化產(chǎn)物抑制可能由于二者都含有羥基，而糖基化終產(chǎn)物AGEs含有二酮結(jié)構(gòu)，親核性的羥基進(jìn)攻糖基化中間產(chǎn)物的羰基，加成反應(yīng)生成不穩(wěn)定的中間體，此中間體發(fā)生多次重排后裂解，促使AGEs交聯(lián)物斷裂[18]，從而使糖基化反應(yīng)得到抑制。

3 結(jié)論

表3 竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)小分子醛類的抑制（%）Table3 Inhibitory effectof bamboo-leaf-flavonoids and glutathione onmicromolecule aldehydes（%）

本文研究了竹葉黃酮與谷胱甘肽對(duì)食源性非酶糖基化體系的抑制作用。竹葉黃酮對(duì)NEG早期產(chǎn)物果糖胺和終期產(chǎn)物AGEs有較強(qiáng)抑制效果，對(duì)二羰基化合物有微弱的抑制效果；而谷胱甘肽對(duì)二羰基化合物和5-HMF有很強(qiáng)的抑制效果，對(duì)小分子醛類物質(zhì)有較強(qiáng)的抑制效果。兩者皆可適當(dāng)抑制食源性糖基化反應(yīng)，減少通過食物直接攝取AGEs，從而降低AGEs引起的相關(guān)疾病。而兩者抑制效果的差別可能與其自身結(jié)構(gòu)差別有關(guān)，相關(guān)機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

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