以菊芋全粉為碳源培養基對乳桿菌的發酵性實驗及發酵條件優化

于濟洋，秦 寧，李新華，王 杕，張 明，鄭鳳娥，王 琳

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866；2.沈陽產品質量監督檢驗院食品安全所，遼寧沈陽110022；3.中國農科院農產品加工研究所，北京110193；4.遼寧大學生命科學院，遼寧沈陽110036）

菊芋（Inulin），俗稱鬼子姜、洋姜。鮮菊芋中含有豐富的營養物質，包括碳水化合物為16.6%（其中78%為菊芋多糖，即菊粉），除以此之外，還含有少量蛋白質、粗纖維、氨基酸、維生素以及多種礦物質[1-4]。保加利亞乳桿菌是一種益生菌，在食品發酵、乳酸發酵、飼料行業和醫療保健領域均有比較廣泛的應用[5-8]，乳桿菌活菌制品的生產和檢驗都必須首先獲得可大量生長增殖的培養基，既要保證培養基對菌種有良好的選擇性，還要培養基原料物美價廉。

研究表明[9-12]菊粉有促進乳桿菌生長的作用，是一種較好的培養基原料，而全粉產品在實際生產中具有工藝相對簡單，營養物質全面利用，產品安全無加工溶劑殘留等優勢。目前，全粉研究主要集中在薯類方面[13-14]，與薯類由淀粉到全粉的研究過程相似的是，大家目前更熱衷于研究菊粉，而忽略了對菊芋全粉的研究，從目前對全粉的認可程度上可以判斷，菊芋全粉同樣會有廣泛的利用價值和應用空間。

本實驗利用菊芋全粉、菊粉作為單一碳源分別取代MRS培養基中的葡萄糖成分發酵培養乳桿菌，并對不同碳源的增殖效果進行比較，進一步研究菊芋全粉對乳桿菌的發酵性。同時對主要條件進行優化獲得最佳發酵培養條件。本研究結果既為乳桿菌的發酵增殖提供了一種快速高效、綠色安全的培養基基礎物質，也為菊芋全粉的應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳桿菌（ASI.1482） 沈陽產品質量監督檢驗院食品安全所菌種保藏中心提供；菊芋全粉、菊粉 實驗室自制；0.85%生理鹽水，0.1mol/L氫氧化鈉溶液。

生物安全柜 賽默飛世爾科技有限公司；2.5L密封培養罐 上海天呈科技有限公司；KQ-250DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HZQX100A恒溫振蕩培養箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；VORTEX3旋渦混勻器 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 乳桿菌瓊脂培養基（MRS瓊脂培養基）：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫1m L，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000m L，煮沸溶解，調pH至7.0（20～25℃）。121℃滅菌20min。4℃下保存備用。（用于活菌檢測計數）

乳酸桿菌肉湯培養基（MRS肉湯培養基）：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，檸檬酸三銨2.0g，酵母膏粉4.0g，乙酸鈉5.0g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鉀2.0g，葡萄糖20.0g，吐溫1m L，加蒸餾水至1000m L，煮沸溶解，調pH至7.0（20～25℃）。分裝于具塞試管中，每管9m L，121℃滅菌20m in。4℃下保存備用。（用于菌種增菌培養）

實驗用培養基（用于菌種的增殖培養）：將葡萄糖碳源替換為實驗用碳源適量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）。菊粉代替葡萄糖，以下稱為菊粉肉湯培養基；菊芋全粉代替葡萄糖，以下稱為菊芋全粉肉湯培養基。

1.2.2 菌種的活化 乳桿菌使用MRS液體培養基活化，得菌種母液。

1.2.3 接種和培養 取培養基于121℃滅菌20m in，冷卻至室溫接入稀釋后的乳桿菌菌種母液，接種量為10%（菌落總數約為4.5×103CFU/m L），培養溫度36℃，培養時間48h。用1m L無菌吸管取稀釋后的實驗用菌種母液勻液，沿管壁緩慢注于裝有9m L生理鹽水、乳酸桿菌肉湯培養基、菊粉肉湯培養基、菊芋全粉肉湯培養基的無菌試管中（共12組，每組3個平行），用渦旋振蕩器振蕩20s，使菌液混勻，放入厭氧缸中厭氧培養，放置（36±1）℃的恒溫培養箱中培養，每4h取出1組試管進行平板計數，培養48h。

1.2.4 菌落總數的測定 參照GB 4789.35食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗。

1.2.5 單因素實驗設計 選擇不同濃度的碳源、發酵溫度、接種量對乳桿菌進行單因素發酵實驗。

1.2.5.1 碳源單因素實驗 發酵溫度為35℃，接種量為10%，菊芋全粉質量濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察碳源濃度對保加利亞乳桿菌發酵的影響。

1.2.5.2 發酵溫度單因素實驗 菊芋全粉質量濃度為2.0%，接種量為10%，發酵溫度分別為30、35、40、45℃，考察不同發酵溫度對保加利亞乳桿菌發酵的影響。

1.2.5.3 接種量單因素實驗條件 菊芋全粉質量濃度為2.0%，發酵溫度為35℃，接種量分別為6%、8%、10%、12%，考察不同接種量對保加利亞乳桿菌發酵的影響。

1.2.6 發酵條件實驗設計 運用Design-Expert 8.0實驗設計對以菊芋全粉作為碳源的培養基對乳桿菌的發酵條件進行三因素三水平的響應面分析實驗，變量為菊芋全粉的添加量（1.5%、2.0%、2.5%）、發酵溫度（30、35、40℃）、接種量（8%、10%、12%）。

表1 Design-Expert8.0實驗設計表Table1 Variables and their levels for Design-Expert experimental design

2 結果與分析

2.1 不同碳源對于乳桿菌增殖情況的比較研究

以菊芋全粉、菊粉和葡萄糖三種物質作為培養基的碳源對乳桿菌進行發酵，乳桿菌生長曲線如圖1所示。由圖1可見，在以菊芋全粉作為碳源的培養基中，乳桿菌生長較快，在4h時，最先達到生長對數期，而且在20h時，活菌總數最先達到最高9.42lg CFU/m L（2.6×109CFU/m L）；而在菊粉和葡萄糖作為碳源的培養基中，乳桿菌在8h時進入生長對數期，較菊芋全粉緩慢，在24h時活菌總數達到最高，分別為8.74lg CFU/m L（5.4×108CFU/m L）和8.43lg CFU/m L（2.7×108CFU/m L），最高活菌總數菊芋全粉培養基是菊粉的4.8倍，是葡萄糖的9.6倍。由此可見，菊芋全粉作為碳源對乳桿菌的增殖效果要優于菊粉和葡萄糖。

由此可見，菊芋全粉作為碳源對乳桿菌的增殖效果要優于菊粉和葡萄糖。李沖等[11]研究了菊芋復合汁增菌培養基對保加利亞乳桿菌的優化篩選，該研究結果排除了菊芋對保加利亞乳桿菌具有抑制作用，與本實驗結論相同，同時李沖等得出優化后的菊芋汁培養基活菌數與實驗室常用的MRS培養基的活菌數相當的結論，此結論與本實驗菊芋全粉是葡萄糖培養基活菌數9.6倍的結論不一致，究其原因一方面是由于優化菊芋汁培養基僅僅培養了16h，菌種生長還未達到穩定期，另一方面是由于本實驗選用的是標準化的培養基，僅僅替換了標準培養基的碳源，其他元素比例處于最優條件，更適合菌種增殖生長。K leessen[12]和Roberfriod[5]分別研究了菊粉對乳酸桿菌顯著促進作用，其實驗結果趨勢與本文相同，而菊芋全粉對保加利亞乳桿菌增殖效果的研究還未見報道，因此對于保加利亞乳桿菌而言該實驗結果更具實際意義。

圖1 保加利亞乳桿菌在不同碳源培養基上發酵的生長曲線Fig.1 Growth curves of Bulgaria lactobacillus in different carbon source culturemediums

2.2 不同碳源對保加利亞乳桿菌代謝pH的比較研究

以菊芋全粉、菊粉和葡萄糖三種物質作為培養基的碳源培養保加利亞乳桿菌，其培養基的pH變化如圖2所示，菊芋全粉培養基的pH下降最快，當20h時pH已經降至4.67，既低于同條件下菊粉和葡萄糖培養基的pH，又低于雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌同時間的pH（課題組其他實驗章節內容），當48h時菊芋全粉的pH降至3.94，是本課題組乳酸菌實驗中唯一一個菌種代謝產物能使培養環境pH低于4的培養基。究其原因很可能是保加利亞乳桿菌是乳酸菌中產酸能力最強的菌種，而且耐酸能力強，保加利亞乳桿菌是制作酸奶必備菌株之一，其發酵生成的乳酸使pH下降至4.5，從而使酪蛋白沉淀制得酸奶，保加利亞乳桿菌利用菊芋全粉同樣能使pH低于4.5，因此添加菊芋全粉發酵制備酸乳具有可行性。

圖2 保加利亞乳桿菌在不同碳源培養基上pH變化曲線Fig.2 pH value curves of Bulgaria lactobacillus in different carbon source culturemediums

2.3 菊芋全粉培養基對保加利亞乳桿菌的發酵條件的篩選

2.3.1 不同碳源濃度對保加利亞乳桿菌發酵的單因素實驗 由圖3可知，碳源對于菌種的發酵的影響是比較顯著的。隨著菊芋全粉的添加量增多，乳桿菌的長勢越好；當菊芋全粉的質量濃度達到2.5%時，菌種的菌落總數與質量濃度為2.0%的菊芋全粉的培養基的菌落總數相差不大，隨著碳源添加量的增加，乳桿菌的增殖趨于平穩。較多的碳源為乳桿菌的增殖提供了充足的養分，過多的碳源超出了乳桿菌的利用范圍，反而會因為菌液濃度的升高抑制菌種的發酵。

圖3 不同碳源濃度對保加利亞乳桿菌發酵的影響Fig.3 Effectof different carbon source concentration on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.3.2 不同發酵溫度對保加利亞乳桿菌發酵的單因素實驗 由圖4可知，發酵溫度對于菌種的發酵有顯著的影響。隨著發酵溫度的升高，保加利亞乳桿菌的生長和繁殖速度加快，35、40℃時，保加利亞乳桿菌的長勢良好；當溫度過高時，酶失活的速度加快，菌種衰老提前，菌種的長勢有所下降。該實驗結果與王奎明等[15]研究保加利亞乳桿菌高密度培養條件相一致。

圖4 不同發酵溫度對保加利亞乳桿菌發酵的影響Fig.4 Effectof different fermentation temperature on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.3.3 不同接種量對保加利亞乳桿菌發酵的單因素實驗 由圖5可知，適當的菌種接種量利用充足的空間和養分進行最大限度的發酵增殖，10%的菌種接種量在全粉培養基的發酵中性價比是最好的，以相對較少的接種量獲得相差不大的菌種量。當菌種量低于8%時，菌種不能充分利用養分；接種量過多，發酵進行的速度加快，菌液濃度變大，抑制菌種的發酵。

圖5 不同接種量對保加利亞乳桿菌發酵的影響Fig.5 Effectof different inoculum size on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.4 菊芋全粉培養基對乳桿菌發酵條件的優化

2.4.1 二次多項式模型的建立與分析 根據表2實驗數據進行擬合，得到一個二元多次式。該方程為描述響應變量（R）與自變量（A、B、C）的經驗模型：R= 2.000×109+2.355×108A+2.227×108B+2.132×108C+1.598×108AB+3.428×107AC+1.934×108BC-7.764×108A2-9.593×108B2-7.734×108C2。

表2 Design-Expert8.0實驗設計及其結果Table2 Design-Expert8.0 experimental design arrangement and results

由表3可見，回歸模型具有高度的顯著性（p＜0.0001），而失擬項差異不顯著（p=0.9286＞0.05），R2= 0.9904，R2adj=0.9781，而且A、B、C均達到顯著水平（p＜0.05），表明此模型對實驗的擬合度很好，可以對乳桿菌得率進行很好的分析和預測，而且該模型適用于優化以菊芋全粉作為碳源的培養基對乳桿菌的發酵條件。由表3還可以看出，因素AB、BC、A2、B2、C2對乳桿菌的發酵得率有顯著的影響（p＜0.05）；因素AC對乳桿菌的得率影響不顯著（p＞0.05）。

由F值可知，各因素對乳桿菌得率的影響依次為A（碳源）＞B（發酵溫度）＞C（接種量）。

表3 二次多項式模型的系數及其方差分析Table3 Coefficients and ANOVA for the developed quadratic polynomialmodel

2.4.2 碳源的濃度、發酵的溫度、接種量對乳桿菌得率的影響 由表3和圖6可知，碳源濃度（A）和發酵溫度（B）具有顯著的交互作用，p=0.0386＜0.05；發酵溫度（B）和接種量（C）也具有顯著的交互作用，p=0.0179＜0.05。碳源的濃度、發酵溫度、接種量三個影響因素中條件濃度或溫度較低時，適量的增加濃度或者提高溫度均可以促進菌體的生長，可以使保加利亞乳桿菌增殖，但在實驗范圍內，碳源的濃度、發酵溫度和接種量之間存在著最佳值，超過最佳值后，增加任意組分的濃度或者提高發酵溫度，均不能提高菌種的單位菌落總數，甚至使菌種的單位菌落總數有所下降。該模型說明乳桿菌可以較好的利用菊芋全粉中的豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪等營養元素進行生長發酵，可以取代葡萄糖。而且菊芋全粉作為培養基中的碳源時，還會對乳桿菌有較好的增殖作用。

2.4.3 最佳工藝條件的預測和檢驗 通過二次多項回歸的預測，得到以菊芋全粉作為碳源的培養基對保加利亞乳桿菌發酵的最佳條件是：碳源的濃度為2.09%，發酵溫度為35.73℃，接種量為10.32%，得到菌落總數為2.05×109CFU/m L。考慮實際操作過程的方便性，將提取工藝參數調整為碳源的濃度為2.1%，發酵溫度為36℃，接種量為10%，實際測得發酵后的保加利亞乳桿菌的菌落總數為2.2×109CFU/m L。因此，該模型與實際情況基本吻合，說明菊芋全粉作為碳源的培養基的發酵條件的優化是可行的。

3 討論

萬榮峰[16]和Kap lan等[10]研究表明，果聚糖能促進乳酸菌生長，抑制有害菌生長，對乳酸菌有益生作用。果糖是菊粉和菊芋全粉的基本成分，由此可以推斷，菊粉和菊芋全粉同樣能促進乳酸菌的生長，該理論推斷在實驗中得到證明。本課題組前期實驗研究了菊芋全粉的發酵性能，得出結論菊芋全粉作為培養基增殖乳酸菌的效果是葡萄糖的9.7倍，但是實驗中的乳酸菌是從酸乳中分離培養的，包括保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌等混合菌種，菊芋全粉對具體每種菌種的增殖效果可能有區別，本研究是具體菌種增殖實驗內容之一，課題組正在對菊芋全粉對其他菌種的發酵性進行研究。菊芋全粉除了具有發酵性能外，還具有凝膠特性，因此一同研究菊芋全粉的凝膠性和發酵特性更具有實用價值，相關工作筆者所在課題組正在進行研究。

圖6 碳源的濃度、發酵溫度、接種量對保加利亞乳桿菌菌落總數影響的響應面圖Fig.6 Response surfaces for the effects of carbon source concentration，fermentation temperature，inoculum size on the total plate countof Bulgaria lactobacillus

4 結論

菊芋全粉具有良好的發酵性，可作為乳桿菌（ASI.1482）培養基碳源使用，活菌的生長情況優于葡萄糖和菊粉。在同一條件下，乳桿菌的增殖數量分別為菊粉的4.8倍、葡萄糖的9.6倍。通過單因素實驗和響應面曲面分析與實際檢測結果確定最佳發酵條件為：碳源的濃度2.1%、發酵溫度36℃、接種量10%，在此條件下保加利亞乳桿菌的菌落總數為2.2×109CFU/m L。本研究結果證明了菊芋全粉具有良好的發酵性能，為菊芋全粉在益生菌培養基碳源應用前景提供了新的研究方向。

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