一氧化氮合酶基因多態性與青年缺血性卒中的關系研究

史從寧，王雅杰，趙運轉，康熙雄

在世界范圍內,缺血性卒中是主要的致死性疾病，其在青年人(15～45歲)中的發病率為3%～5%[1-2]。近年來有一些針對青年缺血性卒中發生機制的研究，凝血因子Ⅴ的Leiden突變、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T的多態性均被認為可能與青年缺血性卒中的發生相關[3-4]。內皮細胞一氧化氮合酶能生成一氧化氮，一氧化氮在血管動態調節方面起重要作用。一氧化氮是強血管擴張劑并能抑制血小板的聚集[5-6]。有試驗表明，一氧化氮依賴的血管擴張活性受損在缺血性卒中的發生中起重要作用[7-8]。盡管做過一些研究，一氧化氮合酶的基因多態性和缺血性卒中的相關性仍不確定，尤其早發性缺血性卒中研究更少，一氧化氮合酶基因多態性和青年缺血性卒中的關系值得研究。本研究檢測一氧化氮合酶內含子4(eNOS4)、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A的多態性，探討其與青年缺血性卒中的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年4月—2012年7月首都醫科大學附屬北京天壇醫院收治的青年缺血性卒中患者97例為研究組，其中男79例，女18例；年齡20～45歲。患者突然發病，迅速出現局限性神經功能缺失癥狀并持續24 h以上，神經癥狀和體征可以用某一血管綜合征解釋，顱腦CT或MRI發現梗死灶，梗死灶位于某一腦血管支配區域，排除腦出血、炎癥性疾病等，即可確診缺血性卒中。另同時期遵循年齡、性別頻數匹配的原則，選擇來自骨外科、普外科、消化內科、呼吸內科等其他科室的非缺血性卒中住院患者99例為對照組，排除心腦血管疾病，其中男80例，女19例；年齡21～45歲。入組患者均經過全面系統的檢查，有詳細的病史和個人史資料。

1.2 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒情況，檢測膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平、eNOS4、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A基因的多態性。

1.3 主要試劑和方法 基因組DNA提取試劑盒購自OMEGA公司；Taq酶、dNTP、20 bp DNA marker、50 bp DNA marker、DL 2000 DNA marker內切酶Hinf I均購自寶生物工程(大連)有限公司；內切酶Mnl I購自NEB公司，引物由上海英駿公司合成；無水乙醇、冰乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)購自北京化學試劑公司；瓊脂糖購自genetech公司；Tris堿購自索萊寶公司。

基因組DNA提取嚴格按照說明書操作。eNOS4多態性測定由PCR完成，選用引物5′-AGCCCAGTAGTGAAGACCTGGTTAT-3′和5′-ACTCTTTGGCGGCCAGTGAT-3′，反應條件為 94 ℃ 5 min變性，35個循環94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到491 bp(4a)和518 bp(4b)的產物。

MTHFR C677T多態性檢測首先進行PCR反應，選取引物5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′和5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反應條件為 94 ℃ 5 min變性，35個循環94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，用Hinf I限制性內切酶進行酶切后用4%的瓊脂糖凝膠進行電泳，得到198 bp的為C等位基因，得到175 bp和23 bp的為T等位基因。

凝血因子Ⅴ G1691A多態性檢測首先進行PCR反應，選取引物5′-TTTCAGGCAGGAACAACA-3′和5′-CTTCGGCAGTGATGGTAC-3′,反應條件為 94 ℃ 5 min變性，35個循環94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到424 bp的PCR產物，用Mnl I限制性內切酶進行酶切后用4%的瓊脂糖凝膠進行電泳，G1691G型得到3個片段(167、220、37 bp),G1691A型得到2個片段(167、257 bp)。

2 結果

2.1 對照組和研究組臨床資料比較 對照組與研究組性別、年齡及HDL水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組高血壓檢出率、糖尿病檢出率、吸煙率、飲酒率及膽固醇、三酰甘油、LDL水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 對照組和研究組臨床資料比較

注：HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；*為t值

2.2 對照組和研究組基因型分布比較 對照組與研究組eNOS4基因型分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組MTHFR C677T基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)；兩組凝血因子Ⅴ基因型均為1691GG。

表2 對照組和研究組基因型分布比較(例)

Table2 Comparison of distribution of genotypes between control group and study group

組別例數eNOS4bb abMTHFRC677TTT CT CC對照組998118344520研究組97907294523χ2值52940586P值00210746

注：eNOS4=一氧化氮合酶內含子4，MTHFR=亞甲基四氫葉酸還原酶

2.3 青年缺血性卒中發生的影響因素 以是否發生缺血性卒中為因變量,以高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒(是=1，否=0)、血清膽固醇、三酰甘油、LDL水平(實測值)、eNOS4基因型(eNOS4 bb=1，eNOS4 ab=0)為自變量。多因素Logistic回歸分析結果顯示，高血壓、糖尿病、吸煙、LDL水平、eNOS4基因型與青年缺血性卒中發生有回歸關系(P<0.05,見表3)。

表3 青年缺血性卒中發生影響因素的多因素Logistic回歸分析

Table3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for the occurrence of ischemic stroke in young people

變量βSEWaldχ2值P值OR值95%CI高血壓187704192007600016532(2874，14846)糖尿病12920611447000343640(1099，12056)吸煙11340400804400053108(1420，6804)飲酒01370389012407251147(0535，2457)膽固醇-08360507272309900433(0160，1170)三酰甘油02340256084003591264(0766，2086)LDL14090606540000204094(1247，13438)eNOS4基因型15650603673200094782(1466，15593)

3 討論

缺血性卒中是一種高發病率、高致殘率、高致死率且高復發率的疾病，是當今嚴重威脅人類健康的三大疾病之一，2008年我國第三次死亡原因回顧性抽樣調查結果顯示，腦血管疾病已經超過惡性腫瘤和心血管疾病，成為我國居民第1位死亡原因[9]。近年來國內外研究均表明,缺血性卒中有年輕化的趨勢,尤其是青年(18～45歲) 缺血性卒中發生有逐年增加的態勢。流行病學相關調查表明，青年卒中占全部人群卒中的9.77%,以缺血性卒中為主,男性患者居多[10]。有研究顯示，青年缺血性卒中最主要的原因是早發性動脈硬化(20%～30%)，高血壓以及不良的生活習慣和嗜好(吸煙、飲酒)是動脈粥樣硬化主要危險因素[11-12]。有研究在尸檢中也證實在15～19歲意外死亡者中主動脈已經出現粥樣硬化的早期病理改變[13]。隨著年齡增長其他高危因素如高血脂、糖尿病等發病率上升也可導致動脈粥樣硬化的發生。本研究發現,青年缺血性卒中患者中高血壓檢出率較對照組高，與李裕茂[14]報道的高血壓是形成青年腦梗死的獨立危險因素相一致，同時本研究也發現，糖尿病患病率、吸煙率、飲酒率、脂代謝指標的水平在研究組和對照組間均存在差異。

在缺血性卒中的發病過程中，遺傳因素也起了很大的作用，對缺血性卒中基因的研究大多采用候選基因法，與青年缺血性卒中有關的候選基因包括血小板相關基因、凝血/纖溶基因、脂代謝基因、同型半胱氨酸代謝基因和其他基因。高凝狀態被認為是青年缺血性卒中的最重要危險因素，在所有能導致高凝狀態的危險因素中，凝血因子Ⅴ的Leiden突變是青年缺血性卒中最危險的基因多態性[15-16]。凝血因子V基因1691位點G被A所取代，使活化蛋白C裂解活化凝血因子V的位點消失，導致活化凝血因子V對活化蛋白C產生抵抗，從而導致血栓前狀態。MTHFR的C677T多態性能導致血清同型半胱氨酸水平升高，也被認為是青年缺血性卒中的危險因素[17]。半胱氨酸在體內通過再甲基化和轉硫化2種途徑代謝，代謝的關鍵酶分別是MTHFR和胱硫醚β-合成酶(CBS)，酶活性的下降是導致高同型半胱氨酸血癥的常見危險因素。MTHFR基因定位于染色體1p36.3，其C667T純合突變使酶活性下降。研究認為，MTHFR的基因突變與青年人缺血性卒中有關，但目前仍存在爭論[18]。內皮源性一氧化氮合酶(eNOS)水解L-精氨酸產生內皮源性一氧化氮(eNO)[19]。研究發現eNO在多種生理過程中以自分泌和旁分泌的方式發揮著重要作用，包括維持腦的基礎血流量、維持腦血管的舒張和自動調節[20]，保持血管的完整性，抑制平滑肌增殖[21]。一氧化氮合酶的基因多態性可導致內皮功能紊亂，也和缺血性卒中相關，但和青年缺血性卒中的關系還不明確。

在本研究中選取青年缺血性卒中患者，年輕人受外界危險因素作用的時間短，發生疾病時基因起的作用要重要，方便找到該疾病的易患基因，其次是由于青年缺血性卒中的發病率有逐年上升的趨勢，這帶來了沉重的社會和經濟負擔。結果顯示凝血因子Ⅴ1691GG未檢測到突變型。這一結果說明凝血因子Ⅴ的Leiden突變不能作為中國青年缺血性卒中的危險因素。與其他研究結果不一致，其原因可能是由于種族特異性[3]。MTHFR 677TT基因型和血清同型半胱氨酸水平升高相關，升高的血清同型半胱氨酸水平可損壞內皮基質導致內皮功能紊亂[22]。但在本研究中，MTHFR 677TT基因型在研究組和對照組間無差異，不支持MTHFR 677TT基因型作為中國青年缺血性卒中的危險因素。eNOS4基因型在研究組和對照組間的分布有差異，對照組eNOS4 ab基因型的攜帶者比研究組多,與Hassan等[23]的研究結果相符。在Hassan等[23]的研究中還發現eNOS4 ab基因型和更高的一氧化氮水平相關。這種內含子的插入缺失多態性和疾病相關可能是由于其影響了mRNA的穩定性和酶水平。

總之，本研究結果eNOS4 bb基因型作為中國青年缺血性卒中的重要基因危險因子和以往的研究結果認為凝血因子Ⅴ的Leiden突變或其他易栓基因多態性是青年缺血性卒中的重要基因危險因子是不同的。提示內皮功能紊亂也許在青年缺血性卒中中發揮重要作用，尤其在中國人群中。但由于本研究樣本量較小，需進一步擴大樣本行長期研究。

1 Hart RG,Miller VT.Cerebral infarction in young adults:a practical approach[J].Stroke,1983,14(1):110-114.

2 Adams HP,Butler MJ,Biller J,et al.Nonhemorrhagic cerebral infarction in young adults[J].Arch Neurol,1986,43(8):793-796.

3 de Paula Sabino A,Ribeiro DD,Carvaho Md,et al.Factor Ⅴ Leiden and increased risk for arterial thrombotic disease in young Brazilian patients[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2006,17(4):271-275.

4 Harmon DL,Doyle RM,Meleady R,et al.Genetic analysis of the thermolabile variant of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for ischemic stroke[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,99(2):208-211.

5 劉建紅，姜平.老年糖尿病伴腦梗死患者血漿一氧化氮和內皮素含量變化的臨床意義[J].中國煤炭工業醫學雜志，2013，16(7)：1143-1144.

6 Lee TH,Hsu WC,Chen CJ,et al.Etiologic study of young ischemic stroke in Taiwan[J].Stroke，2002，33(8):1950-1955.

7 Adams HP Jr,Kappelle LJ,Biller J,et al.Ischemic stroke in young adults:experience in 329 patients enrolled in the lowa Registry of Stroke in young adults[J].Arch Neurol，1995，52(5):491-495.

8 付蓉，唐太峰，王璐，等.法舒地爾對急性腦梗死患者內皮素、一氧化氮以及腫瘤壞死因子的影響[J].實用心腦肺血管病雜志，2012，20(1)：76.

9 陳竺.全國第三次死因回顧抽樣調查報告[M].北京：中國協和醫科大學出版社，2008.

10 畢齊，張茁，張微微,等.2 359例青年腦卒中患者危險因素研究[J].中華流行病學雜志，2003，24(2)：106-108.

11 Chong JY,Sacco RL.Epidemiology of stroke in young adults:race/ethnic differences[J].J Thromb Thrombolysis,2005,20(2):77-83.

12 董小瑾,劉青蕊,姜曄.青年卒中的病因和危險因素[J].國外醫學：腦血管疾病分冊,2005,13(10)：762-765.

13 Strong JP,Malcom GT,McMahan CA,et al.Prevalence and extent of atherosclerosis in adolescents and young adults:implications for prevention from the Pathobiological determinants of atherosclerosis in youth study[J].JAMA,1999,281(8):727-735.

14 李裕茂.青年腦梗塞38例臨床分析 [J].廣西醫學,2004,26(9):1382.

15 Margaglione M,D′Andrea G,Giuliani N,et al.Inherited prothrombotic conditions and premature ischemic stroke:sex difference in the association with factor Ⅴ Leiden[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19(7):1751-1756.

16 Komitopoulou A,Platokouki H,Kapsimali Z,et al.Mutations and polymorphisms in genes affecting hemostasis proteins and homocysteine metabolism in children with arterial ischemic stroke[J].Cerebrovasc Dis,2006,22(1):13-20.

17 Voetsch B,Damasceno BP,Camargo EC,et al.Inherited thrombophilia as a risk factor for the development of ischemic stroke in young adults[J].Thromb Haemost,2000,83(2):229-233.

18 Pezzini A,Del Zotto E,Archetti S,et al.Plasma homocysteine concentration,C677T MTHFR genotype,and 844 ins 68bp CBS genotype in young adults with spontaneous cervical artery dissection and atherothrombotic stroke[J].Stroke，2002，33(3)：664-669.

19 王進，杜波，單愛軍.內皮型一氧化氮合酶基因多態性對一氧化氮水平的影響[J].醫學綜述,2014,20(4):580-583.

20 White RP，Vallance P，Markus HS.Effect of inhibition of nitric oxide synthase on dynamic cerebral autoregulation in humans [J].Clin Sci,2000,99(6)：555-560.

21 Garg UC，Hassid A.Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells[J].J Clin Invest,1989，83(5)：1774-1777.

22 Welch GN,Lascalzo J.Homocysteine and atherothrombosis[J].N Eng J Med，1998，338(15):1042-1050.

23 Hassan A,Gormley K,O′Sullivan M,et al.Endothelial nitric oxide gene haplotyes and risk of cerebral small-vessel disease[J].Stroke,2004,35(3):654-659.