透明質(zhì)酸對體外培養(yǎng)的大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞透明質(zhì)酸合成酶2 mRNA表達的影響

高宗強，郭 雄，陳君長，段 琛，馬瑋娟，劉瑞宇，顧其勝

大骨節(jié)病是一種慢性變形性、地方性的骨關節(jié)病，嚴重危害了病區(qū)人群的健康，目前其發(fā)病原因及機制尚不清楚[1]，其與骨關節(jié)炎具有相似的臨床癥狀、體征及關節(jié)軟骨病理學變化，尚無有效的促進軟骨修復的方法。盡管在最新美國骨科醫(yī)師學會(AAOS)骨關節(jié)炎指南中，對骨關節(jié)炎患者關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸不予推薦，但在既往臨床中，大量病例證實膝關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉可有效緩解大骨節(jié)病、骨關節(jié)炎的癥狀與體征[2-7]。關節(jié)炎患者關節(jié)液中，透明質(zhì)酸含量下降，分子量減小，但軟骨細胞自身合成、分泌透明質(zhì)酸的能力有無變化，相關研究較少。補充外源性透明質(zhì)酸，對軟骨細胞自身合成、分泌透明質(zhì)酸又有何影響，目前亦無相關研究。本課題選擇在透明質(zhì)酸合成酶中至關重要的合成酶2基因作為軟骨細胞透明質(zhì)酸合成能力的觀測指標,將大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞和正常軟骨細胞比較，觀察病理狀態(tài)下軟骨細胞透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)mRNA表達有何變化，并觀察外源性透明質(zhì)酸干預對軟骨細胞自身透明質(zhì)酸合成的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2006年8月—2008年7月陜西地方病研究所明確診斷大骨節(jié)病，并實施膝關節(jié)游離體摘除術后取出的游離體及關節(jié)軟骨6例為大骨節(jié)病組，其中男3例，女3例；年齡35～47歲；西安市紅十字會醫(yī)院明確診斷骨關節(jié)炎，并行全膝關節(jié)置換術后的膝關節(jié)軟骨6例為骨關節(jié)炎組，其中男3例，女3例；年齡57～73歲。符合我國大骨節(jié)病臨床診斷標準(GB16003-1995)[8-9]和美國風濕病協(xié)會骨關節(jié)炎診斷標準(1995年版)[10]診斷大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎。另選擇同時期由于車禍等意外原因截肢或身亡者的新鮮膝關節(jié)軟骨6例為對照組，其中男4例，女2例；年齡27～39歲；取材部位與大骨節(jié)病、骨關節(jié)炎患者一致，均排除了類風濕性關節(jié)炎等其他關節(jié)疾患。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)；小牛血清(蘭州明海生物制品有限公司)；胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶、MTT、 DMSO(SIGMA公司，美國)；AnnexinⅤ-PI染液(深圳晶美生物工程有限公司)；透明質(zhì)酸鈉(上海其勝生物制劑有限公司)；Shel-Lable CO2培養(yǎng)箱(Shel-Lable公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；Nikon雙目光學顯微鏡及纖維照相系統(tǒng)(日立公司，日本)；RNAfast200-總RNA 極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI公司，美國)；PCR mix(MBI公司，美國)；引物合成 (北京奧科生物技術有限責任公司)；Agarose瓊脂糖(solarbio分裝)；DL2000Marker (北京萬農(nóng)先鋒生物技術公司)；

本研究創(chuàng)新點——

本研究對體外培養(yǎng)的人大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞采用不同劑量的透明質(zhì)酸進行干預，檢測干預前后軟骨細胞自身透明質(zhì)酸合成酶2基因mRNA的水平變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎的軟骨細胞透明質(zhì)酸合成酶2表達均有所下降，且骨關節(jié)炎下降更明顯。補充外源性透明質(zhì)酸后，發(fā)現(xiàn)各組軟骨細胞自身合成透明質(zhì)酸的能力均有增加的趨勢，盡管差異無統(tǒng)計學意義，但也為下一步的實驗和臨床使用透明質(zhì)酸提供了一定的參考。對于大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者透明質(zhì)酸合成酶2基因的相關研究，目前尚屬于空白。

PCR儀(ASTEC公司，日本)；GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(SynGene公司，英國)。

1.3 軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

1.3.1 原代細胞的分離與培養(yǎng) 關節(jié)置換術后4 h或死亡后12 h內(nèi)，在無菌條件下取出關節(jié)軟骨，并轉(zhuǎn)移至無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中帶入超凈臺，將軟骨切為1 mm×1 mm的骨粒，先加入10 ml 0.2%的胰蛋白酶，將其放置在37 ℃的搖床上消化1 h，之后加入10 ml 0.1%透明質(zhì)酸酶消化1 h，最后加入10 ml 0.2%的Ⅱ型膠原酶消化4 h，收集含有細胞的上清液，進行離心，離心后吸取上清的膠原酶重新加入錐形瓶中，對其余的軟骨塊進行消化。重復收集細胞3次，將收集的細胞放入200目的濾網(wǎng)中進行過濾，過濾后進行收集離心。離心后放入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中重新懸浮。得到原代細胞后，按照40萬/瓶的密度進行接種，加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各100 U/ml，將培養(yǎng)瓶置于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 d后觀察：關節(jié)軟骨細胞呈多變性，并有細胞少數(shù)貼壁。在培養(yǎng)過程中，可在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。原代細胞在培養(yǎng)箱中72 h后更換培養(yǎng)液，之后每隔48 h進行換液，培養(yǎng)3～4周后形成細胞單層。

1.3.2 傳代培養(yǎng) 待原代培養(yǎng)的細胞長滿后，棄去瓶中的培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞后，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，在倒置顯微鏡下觀察細胞，待細胞明顯皺縮、變圓后加入培養(yǎng)液停止消化，之后吹打懸浮液，收集細胞懸浮液進行離心，離心后按照40萬/瓶的密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，待細胞長滿后，消化細胞，進行下面實驗。

1.4 RNA的提取 消化長滿的1代細胞，按照20×104/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液，每個病例接種一板，在接種48 h后更換培養(yǎng)基：吸去原培養(yǎng)基，分別加入2 ml含不同劑量透明質(zhì)酸鈉的培養(yǎng)液，每個6孔板分為3組，分別為H0(0 μg/ml)、H100(100 μg/ml)和H500(500 μg/ml)，隔天更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)6 d。按RNAfast 200-總RNA極速抽提試劑盒說明書方法提取RNA：每組的兩孔合起在冰上加入500 μl 的RA2液，吹打1 min，使其充分混勻；吸取細胞裂解物置于內(nèi)套管中，按照12 000 r/min(離心半徑30 cm)，4 ℃下離心1 min；將外套管中的液體棄去，給內(nèi)套管中加入500 μl洗液離心1 min；重復此過程一次；取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，按照12 000 r/min(離心半徑30 cm)，4 ℃下離心1 min；將內(nèi)套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入30 μl洗脫液，于室溫下靜置1 min，離心1 min，最終獲得總RNA。

1.5 RT-PCR檢測 按試劑盒的說明采取一步法反轉(zhuǎn)錄cDNA。cDNA 鏈擴增目的DNA雙鏈。在冰上的EP管中加入以下反應體系：PCR mix 12.5 μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA) 1 μl、上游引物1 μl、下游引物和無RNA酶的去離子水1 μl，加至25 μl，將上述混合物充分混合，并離心3～5 s。將上述混合物放入PCR儀中進行擴增。HAS2基因上游引物為：5′-ATTGTTGGCTACCAGTTTATCC-3′；下游引物為：5′-CTTTATGTGACTCATCTGTCTC-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物為：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3′；下游引物為：5′-ACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′。 PCR反應條件為：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 1 min，于70 ℃延伸1 min，共循環(huán)35輪。

1.6 PCR電泳及凝膠成像分析 將PCR產(chǎn)物跑電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像，并分析條帶積分光密度(IOD)值，對各組各條帶與內(nèi)對照GAPDH條帶的IOD值的比值進行分析，從而進行目的mRNA表達的半定量分析。

2 結果

2.1 干預前3組HAS2 mRNA表達比較 干預前3組HAS2 mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中骨關節(jié)炎組較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 干預后不同劑量間HAS2 mRNA表達比較 干預后不同劑量間HAS2 mRNA表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2、圖1)。

Table1 Comparison of HAS2 mRNA expression levels among 3 groups of chondrocytes before treatment

組別例數(shù)HAS2mRNA對照組60654±0018 大骨節(jié)病組60610±0027 骨關節(jié)炎組60552±0099?F值4371P值0032

注：HAS2=透明質(zhì)酸合成酶2；與對照組比較，*P<0.05

Table2 Comparison of HAS2 mRNA expression levels among different dose groups of chondrocytes after treatment

組別例數(shù)對照組大骨節(jié)病組骨關節(jié)炎組H0組60654±00180610±00270552±0099H100組60720±01480620±00600492±0216H500組60686±00790663±00370572±0029F值068424690550P值052001180588

注：1、2、3為對照組H0、H100、H500；4、5、6為大骨節(jié)病組H0、H100、H500； 7、8、9為骨關節(jié)炎組H0、H100、H500

圖1 透明質(zhì)酸鈉干預后各組軟骨細胞HAS2 mRNA PCR擴增產(chǎn)物

Figure1 PCR amplification products of HAS2 mRNA in different groups of chondrocytes after hyluronic acid treatment

3 討論

透明質(zhì)酸是軟骨細胞外基質(zhì)的重要組成部分，蛋白聚糖單體正是通過連接蛋白附著于透明質(zhì)酸鏈上組成聚集蛋白聚糖。其正常的結構和足夠的數(shù)量是保證軟骨基質(zhì)保持正常形態(tài)結構的基礎。在關節(jié)液中，透明質(zhì)酸也是重要組成部分，可以有效減少關節(jié)摩擦，增加關節(jié)潤滑度。

在關節(jié)退變時，關節(jié)軟骨中正常的透明質(zhì)酸鏈發(fā)生降解，附著在透明質(zhì)酸鏈上的聚集蛋白聚糖同時發(fā)生降解，關節(jié)軟骨依靠大分子蛋白聚糖聚集水分的能力極大下降，含水量的下降導致關節(jié)軟骨的彈性降低，分散壓力的能力下降，更容易出現(xiàn)損傷。同時關節(jié)液中大分子透明質(zhì)酸逐步降解為小分子透明質(zhì)酸，并且含量較正常降低，正常的潤滑作用明顯減低。在這也是臨床上關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸治療骨關節(jié)炎和大骨節(jié)病的重要原因。

通過補充外源性透明質(zhì)酸， 外源性透明質(zhì)酸能覆蓋于關節(jié)軟骨和滑膜的表面，防止滑液中的各種蛋白酶和炎性遞質(zhì)通過關節(jié)軟骨表層的“裂痕”進入軟骨基質(zhì)，從而保護膠原和蛋白多糖免受酶的消化，阻斷關節(jié)退變的發(fā)生。增強關節(jié)滑液的潤滑作用，改善關節(jié)的活動功能。并進入軟骨表層與蛋白多糖結合，修復軟骨。可穩(wěn)定傷害性感受器，減輕骨關節(jié)炎患者的疼痛癥狀。

透明質(zhì)酸合成酶(HAS)是一類存在于細胞膜上，能夠特異性作用于透明質(zhì)酸合成的酶。1996年，美國4個實驗室?guī)缀跬瑫r確認了真核生物的HAS-cDNAs，證實人類HAS基因是多基因家族，其編碼3種同工酶[11]:HAS1、HAS2和HAS3。3種HAS都能在細胞中獨立地催化生成透明質(zhì)酸，但活性各不相同[12]，最終表現(xiàn)在生理功能上的不同。HAS3的催化活性大于HAS2，HAS2的催化活性又大于HAS1。Toole[13]通過敲除小鼠HAS1或HAS3基因，發(fā)現(xiàn)小鼠仍可以存活，但是敲除HAS2基因時，小鼠卻難以生存。這是因為在小鼠的胚胎發(fā)育期HAS2的缺乏將會導致透明質(zhì)酸合成不足，引發(fā)嚴重的發(fā)育缺陷，如卵黃囊和心臟缺陷。說明HAS2在發(fā)育中是至關重要的。然而，針對不同分子量透明質(zhì)酸功能差異的研究，目前仍十分有限。HAS1、HAS2、HAS3差別所具有的生理學意義也不十分清楚[14-15]。有研究表明，HAS2與軟骨形成和排卵有關[16]。

Yoshida等[17]通過對比發(fā)現(xiàn)，類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎患者滑液中HAS1、HAS2表達明顯降低，這也許可以解釋類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎滑液中透明質(zhì)酸的含量和分子量都下降。同樣有研究顯示骨關節(jié)炎患者關節(jié)滑膜中HAS2表達量明顯低于正常對照組[18]；在自體軟骨移植修復軟骨缺損過程中HAS2表達量明顯升高[19]。David-Raoudi等[20]觀察到硫酸軟骨素可以增加骨關節(jié)炎患者滑膜、成纖維細胞分泌高分子量透明質(zhì)酸，并認為是通過上調(diào)HAS1和HAS2來實現(xiàn)的，還發(fā)現(xiàn)白介素1β(IL-1β)可以刺激HAS3的表達，硫酸軟骨素可抑制此過程，增加大分子量透明質(zhì)酸的分泌。

對于大骨節(jié)病患者中HAS的變化,目前尚無相關研究數(shù)據(jù)。曹佩華等[21]發(fā)現(xiàn)中濃度雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)毒素可顯著促進HAS2 mRNA表達，提示在一定范圍內(nèi)毒素可刺激關節(jié)軟骨合成透明質(zhì)酸。在另一項研究中，Li等[22]發(fā)現(xiàn)T-2毒素可以降低HAS2 mRNA表達，似乎不同毒素對關節(jié)軟骨細胞HAS2 mRNA的表達影響不同。

本實驗結果顯示，大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者中HAS2表達量有所降低，表明了在大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者軟骨細胞自身透明質(zhì)酸的合成能力是下降的。這也為臨床上關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸提供了理論基礎。補充外源性透明質(zhì)酸鈉干預后有一定的促進軟骨細胞HAS2 mRNA表達的趨勢，盡管無統(tǒng)計學差異，但也許能給我們提示，補充外源性透明質(zhì)酸還能促進軟骨細胞自身透明質(zhì)酸的合成。這也許能解釋為什么臨床上關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉后，療效仍能長時間維持。

正是由于高分子量透明質(zhì)酸在退變關節(jié)中作用明顯，而內(nèi)源性透明質(zhì)酸又主要是由HAS2催化生成的，Zhang等[23]提出設想，可將HAS2基因轉(zhuǎn)染入關節(jié)，也許可以長期有效地刺激內(nèi)源性高分子量的透明質(zhì)酸產(chǎn)生，與傳統(tǒng)的關節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉相比，作用時間更為持久，可有效避免因反復注射帶來的并發(fā)癥，具有很好的臨床應用前景，也許可作為治療骨關節(jié)炎的一個新途徑，并于2007年成功地構建了pEGFP-N3-HAS2真核表達載體，并證實經(jīng)該載體瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細胞，可高效表達HAS2-EG-FP融合蛋白。

提示，也許可以將HAS2基因作為大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎治療方面一個新的基因靶點。

本實驗也有一定的缺陷，至于外源性透明質(zhì)酸干預后只有變化的趨勢，沒有統(tǒng)計學差異，可能與樣本量過小，而且，早期實驗條件所限，采用的是半定量的RT-PCR有關，沒有采用更為客觀的實時定量PCR，影響了實驗數(shù)據(jù)的精確性，且缺乏蛋白方面的驗證。但添加外源性透明質(zhì)酸后促進軟骨細胞自身HAS2基因表達的趨勢，也能給臨床使用透明質(zhì)酸提供一定的參考。

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