一株酸性淀粉酶產生菌的分離鑒定及其酶學性質研究

劉 洋，王一琰，白黎婧，相宏宇，朱洪亮，謝秋宏，*

（1.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012；2.淄博國澳生物酶技術有限公司，山東淄博255000）

一株酸性淀粉酶產生菌的分離鑒定及其酶學性質研究

劉 洋1，王一琰1，白黎婧1，相宏宇1，朱洪亮2，謝秋宏1，*

（1.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012；2.淄博國澳生物酶技術有限公司，山東淄博255000）

用含有淀粉的選擇培養基，通過透明圈法篩選到一株產酸性淀粉酶的菌株，其發酵液酶活力達到123U/mL。通過形態觀察。生理生化實驗和16S rDNA序列分析等方法初步鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。對其產生的淀粉酶的酶學性質進行分析發現，該菌株產生的淀粉酶最適反應溫度為70℃；最適反應pH為4.5，同時具有較好的熱穩定性和pH穩定性；Ca2+和Mg2+對該酶有激活作用，Mn2+和Cu2+對該酶有抑制作用，抑制劑PMSF（苯甲基磺酰氟）及DTT（二硫蘇糖醇）對該酶活力影響較小。通過PAGE分析發現BW-2產生的淀粉酶與已知熱穩定淀粉酶分子量或結構可能存在差異。Bacillus lincheniformis BW-2是一株具有研究開發潛力的產酸性淀粉酶的菌株。

酸性淀粉酶，菌株篩選，分離鑒定，酶學性質

α-淀粉酶[EC3.2.1.1]屬于糖苷水解酶類。它水解淀粉的α-1，4和α-1，6糖苷鍵，同時生產低分子量產物如葡萄糖、麥芽糖和麥芽糊精等。淀粉酶廣泛分布于自然界。所有植物、動物和微生物幾乎都含有淀粉酶。淀粉酶是研究較多、生產最早、應用最廣和產量最大的一種酶，其產量占整個世界酶生產市場的30%以上[1-2]。淀粉酶在工業上被廣泛用于燃料酒精、淀粉糖漿、傳統釀造、食品加工和紡織退漿等行業[3-5]。

在淀粉加工過程中，淀粉酶首先在高溫下液化淀粉，淀粉漿的自然pH通常為4.5左右[6]，而大多數的商品細菌α-淀粉酶最適作用pH約為6.5左右[7]，且在低pH條件下不穩定。因此，pH在淀粉液化前需調至5.8～6.2。然后再進行糖化酶糖化步驟。但糖化酶的最適作用pH通常在4.5左右，因此，液化淀粉pH又必須調至酸性。兩步pH調節過程大大的增加了淀粉加工成本。雖然諾維信與杰能科兩大酶制劑公司已相繼推出最適pH為5.0的淀粉酶，但其在較低pH下酶活力明顯降低[8-11]。近年來，國內外對酸性淀粉酶生產菌株做了大量研究。謝建華等[12]篩選到一株解淀粉芽孢桿菌，其產生的酸性淀粉酶最適pH為5.0，最適溫度為40～45℃。錢萍[13]通過復合誘變黑曲霉，獲得一株酶活力比原始菌株提高10倍的誘變株，同時該誘變株產生的酸性淀粉酶最適pH為4.0，且在50℃、pH4.0條件下酶活力穩定。Sajedi等[7]分離到一株酸性淀粉酶產生菌Bacillus sp.KR-8104，并對其產生的酸性淀粉酶進行了純化和酶學性質分析。盡管目前對酸性淀粉酶的研究很多，但還沒有一株酸性淀粉酶菌種達到工業要求[13]。因此，篩選獲得產酸性淀粉酶生產菌株具有重要意義。

本研究從長白山溫泉口土壤中篩選到一株酸性淀粉酶生產菌株，對其進行了形態觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列分析，并進一步研究了其產酶的酶學性質，同時與現有熱穩定淀粉酶進行了PAGE分析對比。該研究對酸性淀粉酶產生菌及其基因資源的開發提供了重要的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究樣品 采自長白山溫泉口土壤；熱穩定淀粉酶X1 為本實驗室保存；可溶性淀粉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 分析純，北京奧博星生物技術有限公司；氯化鈉等 分析純，北京化工廠；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術有限公司；篩選培養基（g/L） 生玉米淀粉 300，NaNO32，KH2PO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，瓊脂20，pH4.8；種子培養基（g/L）

酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH5.0；發酵培養基（g/L） 酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，可溶性淀粉10，pH5.0。

超凈工作臺SW-CJ-2FD 蘇凈集團安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫培養箱DNP-9162 上海精密科學儀器有限公司；雙層小容量全溫度恒溫搖床ZHWY-2102C 上海智城分析儀器制造有限公司；電子分析天平FA2204B 上海精密科學儀器有限公司；滅菌器54DWS 廈門致微儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選方法 取2g土樣，加入到裝有50mL無菌水的250mL錐形瓶中，內有無菌玻璃珠若干，將土樣振蕩搖均后，用無菌水將其梯度稀釋，取適宜梯度稀釋液100μL，涂布于篩選培養基上，于37℃培養箱倒置培養48h；待菌落長出后，用碘熏蒸；將透明圈較大的菌株分別進行分離、純化后，發酵制取粗酶液，通過酶活力測定進行復篩，將酶活力較高的菌株甘油保存，供進一步菌種鑒定及酶學性質分析用[14]。

1.2.2 粗酶液的制備 將菌株接種于種子培養基中，37℃，150r/min培養48h。以2%接種量接種于發酵培養基內，37℃，150r/min發酵72h。將培養液12000r/min，離心10min上清液即為發酵粗酶液。

1.2.3 淀粉酶活力的測定 淀粉酶活力測定：根據參考文獻[15]采用小體系DNS法測定淀粉酶活力，以2%的可溶性淀粉為底物，加入100μL 50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖液，60℃水浴鍋內保溫30min，迅速取出，放入冰浴內，并向反應體系中加入20μL，1mol/L NaOH終止反應。然后從反應體系中取出50μL反應液，加入到盛有100μL去離子水的EP管內，再加入200μL DNS溶液，沸水浴準確反應5min。從中取出20μL至96孔板內，再加入250μL水，混合均勻后，測量540nm處吸光度值。根據葡萄糖標準曲線計算酶反應釋放的還原糖量，從而計算淀粉酶活力。淀粉酶活力定義為：在實驗條件下，1h釋放1mg的還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4 菌株的形態觀察及生理生化實驗 將復篩中酶活力較高的菌株進行甘油保存后，分別接種于固體篩選培養基及液體種子培養基內。37℃培養48h后，觀察固體平板上的菌落形態及淀粉水解圈大小，從培養液中吸取少量菌液在顯微鏡下觀察顯微形態。菌株的生理生化實驗參照文獻[16]進行。

1.2.5 菌株的16S rDNA序列分析 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1401R（5′-GCGTGTGTACAAGACCC-3′）擴增細菌的16S rDNA[17]。擴增體系為20μL：2×rTaq 10μL，引物各0.8μL，模板0.4μL，補加ddH2O到20μL。擴增程序為：94℃4min；94℃40s，55℃50s，72℃100s，30個循環；72℃10min。PCR產物連接至TA載體后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序結果在NCBI上進行BLAST同源比對分析，選取同源性較高的序列經ClustalX程序比對后，用MEGA 4.1軟件采用鄰接法構建系統發育樹[18]。（GenBank accession number：KF311767）

1.2.6 溫度對淀粉酶活力的影響 分別測定粗酶液在pH6.0，溫度為40、50、60、70、80、90℃時的酶活力，反應時間為30min，以酶活力最高時的相對酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，以考察溫度對酶活力的影響。

1.2.7 pH對淀粉酶活力的影響 分別測定粗酶液在70℃，pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時的酶活力，反應時間為30min，以酶活力最高時的相對酶活力為100%，計算其他pH下的相對酶活力，以考察pH對酶活力的影響。

1.2.8 淀粉酶熱穩定性實驗 取一定量酶液，分別在pH4.5，70、80、90℃水浴條件下保溫處理，每隔一定時間取樣一次，并迅速冷卻，在最適條件下測定酶活力，以初始酶液為對照樣品，測定不同時間下淀粉酶的殘余活力。

1.2.9 淀粉酶pH穩定性實驗 取一定量酶液，分別在pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0條件下，70℃水浴保溫30min后，在最適條件下測定酶活力，以酶活力最高時的殘余活力為100%，計算不同pH下的殘余酶活力。

1.2.10 金屬離子及抑制劑對酶活力的影響 在酶反應體系中分別加入Ca2+、Na+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、K+、Cu2+和Fe2+及PMSF和DTT，使其在酶反應體系的終濃度為5mmol/L，以不加金屬離子及抑制劑的樣品為對照，分別進行酶活力測定，以對照樣品的酶活力為100%，計算在不同金屬離子及抑制劑存在時的相對酶活力，以考察其對酶活力的影響。

1.2.11 PAGE分析淀粉酶 將BW-2發酵液，濃縮后，作PAGE分析。以菌株Bacillus lincheniformis產生的熱穩定α-淀粉酶X1作為陽性對照。樣品于80℃水浴中處理10min后上樣進行PAGE分析。同時作兩塊PAGE，電泳結束后，一塊膠進行考馬斯亮藍染色，另一塊膠在含有2%可溶性淀粉的pH6.0磷酸緩沖液中浸泡振蕩1h，然后于70℃中酶解1h后用稀碘液染色。

1.3 數據處理

采用Excel及Origin 7.5軟件進行數據處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

經過水解圈法初步篩選，從200個菌落中獲得了菌落形態不同、水解圈較大的11個菌株，將它們分別分離、純化發酵培養后，進行酶活力測定復篩。結果發現其中1株產淀粉酶活力最高，其粗酶液活力為123U/mL，高于已有文獻報道[4，18]。我們將該菌株暫定命名為BW-2，并對其進行了形態學觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列分析以及所產生的α-淀粉酶的酶學性質研究。

2.2 菌株的形態觀察、生理生化實驗及16S rDNA序列分析

形態及顯微觀察結果如圖1所示，A為形態觀察結果，B為顯微觀察結果，從實驗結果可以看出，菌株在篩選培養基上表面干裂，呈白色，同時培養基上有明顯的淀粉水解圈；從顯微觀察結果可以看出，該菌株有芽孢，且明顯為短桿狀。菌株的生理生化特征見表1。由形態觀察及生理生化特征結果可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

圖1 菌株BW-2的形態觀察Fig.1 Morphological observation of the stain BW-2注：A：固體培養基上形態觀察；B：顯微鏡觀察（16×40）。

表1 菌株BW-2的常規生理生化反應特征Table.1 Ttadition taxonomical properties of the strain BW-2

進一步對菌株進行16S rDNA序列分析，提取該菌株基因組DNA，用通用引物27F和1401R，以基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增產物約為1400bp，經膠回收連接到TA載體上，轉化至大腸桿菌中。提取質粒后，進行測序。所測得序列大小為1402bp，在NCBI上進行BLAST，該菌株與地衣芽孢桿菌一些種的序列同源性最高，達到99%以上，與相關菌株親緣關系見圖2。結合菌株的形態特征、生理生化實驗及16S rDNA序列分析，最終確定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。

2.3 溫度對酶活力的影響

圖2 BW-2菌株16S rDNA系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of BW-2

溫度對酶活力的影響如圖3所示，從圖3中可以看出，該淀粉酶的最適反應溫度為70℃，同時，該酶具有較寬的反應溫度范圍，在60～90℃時都能保持90%以上的相對酶活力。該實驗結果與Arikan報道的由Bacillus sp.A3-15生產的熱穩定性淀粉酶最適溫度一致，同時兩者都具有較寬反應溫度范圍[19]。

（4）對于蝦蟹養殖戶，政府暫無相應補貼與鼓勵政策，養殖戶通過購買商業保險降低自身風險。養殖戶自產自銷，基本無滯銷現象。土地承包商雇傭當地的閑置勞動力，閑置勞動力年齡一般為60周歲以上。

2.4 pH對酶活力的影響

圖3 溫度對酶活力影響Fig.3 Effect of temperature on activities of amylase

pH對酶活力的影響如圖4所示，從圖4中可以看出，該酶最適反應pH為4.5，在3.5～7.0范圍內，其相對酶活力可以維持在90%以上。該結果說明，菌株Bacillus lincheniformis BW-2生產的淀粉酶為酸性淀粉酶[12]。Liu等[20]從一種新型芽孢桿菌YX-1中提取了一種α-淀粉酶，最適作用pH同樣為4.5。但其最適作用溫度為40～50℃，大于60℃時，其酶活力顯著下降。因此Bacillus lincheniformis BW-2產生的淀粉酶與YX-1相比，在淀粉水解工藝中有更大的使用空間。

2.5 淀粉酶的熱穩定性

淀粉酶的熱穩定性的實驗結果如圖5所示，從結果中可以看出，菌株Bacillus lincheniformis BW-2產生的淀粉酶在70℃保溫120min，其殘余酶活力仍能維持100%，在80℃條件下保溫120min，其殘余酶活力可以維持在82%，說明該酶在酸性條件下有良好的熱穩定性。

2.6 淀粉酶的pH穩定性

圖4pH對酶活力影響Fig.4 Effect of pH on activities of amylase

圖5 酶的熱穩定性Fig.5 Thermal stability of the amylase

圖6 酶的pH穩定性Fig.6 pH stability of the amylase

2.7 金屬離子及抑制劑對酶活力影響

金屬離子及抑制劑對酶活力的影響如圖7所示。從圖7中可以看出，與對照相比Ca2+和Mg2+對菌株Bacillus lincheniformis BW-2所產生的淀粉酶有激活作用。推測其可能是鈣依賴的淀粉水解酶類。Mn2+和Cu2+有抑制作用，而其他離子對淀粉酶沒有影響。抑制劑PMSF及DTT對淀粉酶活力影響較小。PMSF為絲氨酸抑制劑，可能是由于絲氨酸不是該淀粉酶的活性中心。DTT可以還原蛋白質二硫鍵，可能是由于該蛋白質不存在二硫鍵或二硫鍵的破壞并不影響該淀粉酶活性中心的結構。

2.8 淀粉酶的PAGE分析

圖7 金屬離子和變性劑對酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions and inhibitor on enzymatic activity

對BW-2發酵液和X1按1.2.11的方法處理后，實驗結果如圖8所示，由圖8可以看出，熱穩定淀粉酶X1和BW-2發酵液在80℃水浴10min后均有較明顯的淀粉酶水解條帶，說明BW-2生產的淀粉酶與熱穩定淀粉酶X1耐熱性質相似，在80℃的條件下，保溫10min仍有水解淀粉能力，同時，從兩者亮帶位置的差異來看，BW-2產生的淀粉酶與熱穩定淀粉酶X1的分子量或結構可能存在差異，推測其是新的淀粉酶，這一結論需要進一步的實驗驗證。

圖8 淀粉酶的PAGE分析Fig.8 PAGE analysis of the amylase

3 結論

本研究使用含淀粉的選擇培養基，從長白山溫泉土壤中篩選到一株產酸性淀粉酶的產生菌株，其發酵液活力為123U/mL。通過形態觀察、生理生化實驗及16S rDNA序列分析初步確定其為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。進一步對其酶學性質分析發現，該淀粉酶最適反應溫度為70℃，最適反應pH為4.5；在pH4.5的條件下，70℃和80℃保溫120min，其殘余活力分別為100%和82%，說明其有較好的熱穩定性，pH4.5～7.0，70℃保溫30min，其殘余活力均可維持在90%以上，說明其具有較好的pH穩定性。通過研究金屬離子及抑制劑對酶活力影響發現，Ca2+和Mg2+對該淀粉酶有激活作用，Mn2+和Cu2+有抑制作用，抑制劑PMSF及DTT對該淀粉酶活力影響較小。通過PAGE分析發現BW-2產生的淀粉酶與已知熱穩定淀粉酶分子量或結構可能存在差異。本研究為菌株下一步的培養基和培養條件優化，菌種改良及酸性淀粉酶的應用，提供了重要的實驗基礎和材料基礎。

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Study on isolation and identification of acidic α-amylase producing strain and enzymatic properties

LIU Yang1，WANG Yi-yan1，BAI Li-jing1，XIANG Hong-yu1，ZHU Hong-liang2，XIE Qiu-hong1，*
（1.School of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China；2.Zibo Guoao Biological Enzyme Technology Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

An acidic α-amylase producing strain was screened through screening medium supplemented with starch by the method of hydrolysis halo，and the amylase activity of the fermentation broth was 123U/mL.The stain was identified as Bacillus lincheniformis by morphology observation，physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis，and was named as Bacillus lincheniformis BW-2.The enzymatic properties of the amylase were also investigated.The optimum pH and temperature of the amylase was 4.5 and 70℃，respectively.It also showed excellent thermostability and pH stability.The amylase activity was activated by Ca2+and Mg2+，whereas，it was inhibited by Mn2+and Cu2+.Meanwhile，these inhibitors PMSF and DTT had little effect on the enzyme activity.The molecular weight and structure of the amylase from BW-2 maybe was different from the known thermostable amylase by PAGE analysis.BW-2 was an acidic amylase producing strain which showed research and development potential.

acidic amylase；screening；isolation and identification；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0174-05

2013－07－16 *通訊聯系人

劉洋（1983-），男，在讀博士研究生，主要從事微生物酶方面的研究。

國家自然科學基金項目（81072564）；吉林省科技廳科技發展計劃重點項目（20090945）。