胖大海提取液阻斷草酸鈣結石形成的實驗研究

王潤霞 王秀芳 沈玉華 魯文勝

（1 安徽師范大學化學與材料科學學院，安徽 蕪湖 241000）

（2 安徽醫學高等專科學校藥學系，安徽 合肥 230601）

（3 安徽建筑大學材料與化學工程學院，安徽 合肥 230601）

（4 安徽大學化學化工學院，安徽 合肥 230039）

（5巢湖學院化學化工與生命科學學院，安徽 合肥 238000）

尿結石是泌尿系統各部位結石病的總稱，是泌尿系統的常見病。尿結石實際上某些物質在人體發生了異常礦化，是一種生物礦石[1]，其中70-80%的晶體成分為草酸鈣（CaOxa），它的存在有三種形式：一水草酸鈣（CaOxa·H2O，COM）、二水草 酸 鈣 （CaOxa·2H2O，COD） 和三 水 草 酸 鈣（CaOxa·3H2O，COT），COM 熱力學最穩定， 其次是COD，最不穩定的是COT。由于COM熱力學穩定狀態較高，因此約70%以上的草酸鈣結石是這種晶型[2]。尿結石發病率、復發率較高[1]，如何預防尿結石的形成是醫學領域的熱點問題。

研究表明，許多植物藥已經成為預防和治療尿結石的重要醫療手段，因為其對尿結石有預防和治療效果且具有信價比較高、副作用較小的優點[3]。

目前，我國治療泌尿結石已嘗試采用中草藥方劑的方法，并對其治療機制進行了初步的探索[4-9]。 中藥胖大海（sterculia scaphigera）又名大海子、通大海、大洞果、安南子、大發等，為梧桐科蘋婆屬燈籽萍婆的成熟種子，主產于東南亞，其中老撾產量最大，經引種栽培，廣東、海南島亦產[10-12]，是傳統的清咽利喉的藥食兩用藥材。曾有文獻報道[13]胖大海阻斷草酸鈣結晶形成的臨床觀察，但對其阻斷機制未見報道。本論文研究了單味中藥胖大海不同濃度的提取液對正常人體尿液中草酸鈣晶體生長的影響及其化學基礎，這將為胖大海在臨床上作為防治尿結石的有效藥物提供理論的依據。

1 實驗部分

1.1 試劑

分析純草酸鈉 （常州蘇杭精細化工有限公司），分析純無水氯化鈣（章丘市魯洪化工有限公司），水為二次水。胖大海為廣東所產。

1.2 儀器

掃描電子顯微鏡（SEM）為日立牌S4800型，加速電壓0.1～30KV；用 MAP18XAHF型X-射線衍射儀進行物相測試，掃描速度40/min；用德國Bruker公司生產的Equinox55型傅立葉變換紅外吸收光譜儀測試樣品的紅外光譜；用北京時代北利離心機有限公司生產的GT10-1型高速臺式離心機進行離心操作。

1.3 實驗方法

1.3.1 尿液處理

將質量濃度為2%的疊氮化鈉溶液0.5ml加在收集的正常人尿液200ml中，以防止尿液變質。之后，過濾尿液，在濾液中加入200ml生理鹽水稀釋，攪拌均勻后待用。

1.3.2 胖大海提取液的制備

秤取胖大海100g于砂鍋中，加入二次蒸餾水4000ml，煮沸60分鐘，進行過濾，將濾液收集。再加4000ml二次蒸餾水于留有濾渣的砂鍋內，煮沸40分鐘，再進行過濾，將濾液收集。將兩次濾液進行合并，繼續煮沸濃縮，分別濃縮成含生藥 0.1g·ml-1，0.2g·ml-1，0.5g·ml-1，1.0g·ml-1的胖大海提取液，并將轉速調整為11000轉/分，分別用高速離心機進行離心，取出上面的清液備用。

1.3.3 胖大海提取液對草酸鈣晶體生長的影響實驗

將 50ml 5mmol·L-1的 Na2C2O4溶液、25ml經處理的尿液、50ml 5mmol·L-1的 CaCl2溶液和50ml二次蒸餾水依次加入一只潔凈的燒杯中，攪拌均勻，經24h靜置陳化后離心分離，所得樣品干燥后待測。 分別用含生藥 0.1g·ml-1、0.2g·ml-1、0.5g·ml-1、1.0g·ml-1的胖大海提取液替換二次水，同法操作，所得樣品干燥后分別用掃描電子顯微鏡（SEM）、X-射線衍射儀、紅外光譜儀進行測試。

2 結果與討論

2.1 不同濃度的胖大海提取液對草酸鈣晶體生成的影響

2.1.1 樣品的SEM表征

圖1 不同濃度胖大海提取液中草酸鈣的SEM圖

圖1為通過掃描電鏡觀察到的草酸鈣晶體在不同條件下形成的形貌。未加胖大海提取液時尿液中生長的草酸鈣晶體為不規則的六邊形片狀結構（圖 1a）；當加入 0.1g·ml-1有兩種形貌（圖1b），一種是大小不一的不規則的六邊形片狀結構，另一種是四方錐形晶體；當加入0.2g·m l-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體（圖1c），與圖1b相似，也有兩種形貌；當加入0.5g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體為大小均勻的四方錐形晶體（圖 1d）；加入 1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體為四角雙錐柱形（圖1e）。由于COM型晶體是六邊形片狀結構[14]，COD晶體形狀為四方錐形[15]，可以判斷，未加胖大海提取液的尿液中生長的草酸鈣晶體為 COM 型；當分別加入 0.1g·ml-1、0.2g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體是COM與COD共存的草酸鈣晶體；當分別加入0.5g·ml-1、1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體為COD型晶體，同時比較圖1d、1e，可以看出，加入1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體體積（柱體長約為1.5μm）比加入0.5g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體體積（平均邊長約2.5μm）小。從以上討論推測，胖大海提取液對尿液中生長的草酸鈣晶體的影響是隨著胖大海提取液濃度增大，草酸鈣晶體以COD晶體存在的趨勢增大，所得COD晶體尺寸隨之減小。因此可以判斷胖大海提取液能阻斷尿液中生長的向COM晶體轉化，且能減小COD晶體尺寸。

2.1.2 樣品的FTIR光譜

圖2 不同濃度胖大海提取液中草酸鈣的FTIR譜圖

圖2為不同濃度胖大海提取液中生長的草酸鈣晶體的FT-IR譜圖。未加胖大海提取液時，生長的草酸鈣晶體的FT-IR光譜圖 （圖 2a）顯示，COO-的伸縮振動帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對稱伸縮振動帶 νas（COO-） 在 1615cm-1和1670cm-1處出現雙峰；圖 2b是在加入0.1g·ml-1胖大海提取液中生長的草酸鈣晶體的FT-IR光譜，COO-的伸縮振動帶 ν（COO-）為 1325cm-1，νas（COO-） 在 1618cm-1和 1650cm-1處出現雙峰，并在655cm-1和620cm-1處又出現雙峰；在加入0.5g·ml-1胖大海提取液中生長的草酸鈣晶體的FT-IR 光譜（圖 2c）顯示，1325cm-1為 COO-的伸縮振動帶 ν（COO-），在 1618cm-1和 1660cm-1處的雙峰為 νas（COO-），在 618cm-1處出現指紋區特征峰；當加入1.0g·ml-1胖大海提取液時，尿液中生長的草酸鈣晶體的FT-IR光譜（圖 2d）顯示，1325cm-1為 COO-的伸縮振動帶 ν （COO-），在1620cm-1和 1655cm-1的雙峰為 νas（COO-），在指紋區特征峰出現在618cm-1處。由于COM晶體的COO-的伸縮振動帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對稱伸縮振動帶νas（COO-）雙峰位置為 1615cm-1、1670cm-1，特征峰為655cm-1；COD晶體的COO-的伸縮振動帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對稱伸縮振動帶 νas （COO-） 雙峰位置為 1618cm-1、1655～1660cm-1、特征峰為 618～620cm-1[16]，因此，可以推測當未加胖大海提取液的尿液中生長的草酸鈣晶體為COM晶體； 當分別加入 0.1g·m l-1、0.5g·ml-1胖大海提取液時，尿液中生長的草酸鈣晶體為COM和COD共存的晶體；當加入的胖大海提取液濃度達到一定量，如達到1.0g·ml-1時，尿液中生長的草酸鈣晶體主要COD晶體，與SEM推測結果一致。

2.1.3 不同濃度胖大海提取液條件下的草酸鈣晶體的XRD圖

圖3 加入不同濃度胖大海提取液后尿液中生長的草酸鈣晶體的XRD圖譜

圖3為在不同濃度胖大海提取液中生長的草酸鈣晶體的XRD圖譜。尿液中生長的草酸鈣晶體在未加胖大海提取液時的XRD譜（圖3a）顯示，位于 15.08°，24.44°和 30.20°處的衍射峰分別對應于COM晶體（JCPDS卡片號：20-0231）的（01）、（020）和（02）晶面；圖 3b 為加入 0.1g·ml-1的胖大海提取液后生長的草酸鈣晶體的XRD譜，2θ 為 14.22°，19.90°，32.22，37.16°和 40.23°處的衍射峰分別對應于COD晶體（JCPDS卡片號：17-0541）的（200），（211），（411），（103）和（213）晶面，因此，可以推測，未加胖大海提取液在尿液中生長的草酸鈣晶體為COM晶型；加入濃度為0.1g·m l-1的胖大海提取液后生長的草酸鈣以COM、COD兩種晶型共同存在；圖3c與圖3b比較發現圖3c中COM型晶體的衍射峰除（020）面衍射峰外，其它衍射峰基本消失，表明此時草酸鈣晶體主要以COD晶型存在，還有少量COM晶型存在；而圖3d與圖3c比較，則與其相似，表明此時所得草酸鈣晶體也主要為COD型；圖3e與圖3c、圖3d相似，但COD型晶體的衍射峰明顯增強，表明此時所得草酸鈣晶體也主要為COD型。以上結果與SEM圖及FTIR光譜推測的結果吻合。

2.2 胖大海提取液對草酸鈣結晶影響的機理探討

圖4 胖大海提取液的紅外光譜

在500～3000cm-1范圍內，用KBr壓片法分別測定胖大海提取液、胖大海提取液與CaCl2溶液的混合液的紅外光譜，見圖4。由圖4a中可以看出位于1650cm-1、1410cm-1處有吸收峰，從有機基團紅外光譜圖譜所查，得知位于1650cm-1處的吸收峰是νsC=O的伸縮振動，1410cm-1處的吸收峰是νC-OH的振動峰，這是由于胖大海提取液中含有阿拉伯糖、半乳糖等多糖[18]的原因。從胖大海提取液與CaCl2溶液混合液的紅外光譜圖（圖4b）可看出，胖大海提取液中加入CaCl2溶液后，νsC=O的伸縮振動峰及νC-OH的振動峰發生變化，向高頻移動，分別移至1660 cm-1和1450cm-1。這可能是由于胖大海提取液中多糖的羥基、羰基等通過配位作用與Ca2+結合形成可溶性配位化合物，降低了Ca2+與Oxa2-的結合能力，使得CaOxa的成核和生長被抑制。

3 結論

COM型草酸鈣晶體熱穩定性比COD型強，只有使用添加劑將COD全部覆蓋，COD在尿液溶液中才能不轉化為COM型晶體[17]。因此，本論文實驗中，當加入胖大海提取液濃度較小（≤于0.1g·ml-1）時，COD晶面不能全部被其有效成分多糖分子包裹，因而COD轉變為COM的趨勢不能完全被阻斷，故COM和COD兩種晶型會共同存在。當胖大海提取液濃度足夠大（≥0.5g·ml-1）時，其有效成分多糖分子與COD的吸附鍵合點較多，COD晶面可能全部被其有效成分多糖分子包裹，導致COD轉變為COM受阻，則形成的草酸鈣晶體主要為COD型。

胖大海提取液中的阿拉伯糖、半乳糖等有機分子能夠使草酸鈣亞穩溶液中的可溶性Ca2+離子濃度增加，使COM晶體的生長受到阻斷，從而減少了COM晶體的聚集，并且由于胖大海提取液含有的多糖的羰基和羥基與Ca2+配合，通過配位平衡覆蓋了COD晶體，阻斷其轉化為COM晶體，使COD晶體相對穩定，并且這種阻斷作用隨著胖大海提取液濃度增大而增大。由于COD型晶體與腎小管細胞的細胞膜結合力較小，易于隨尿液排出體外，故胖大海提取液能阻斷COD晶體轉化為COM晶體的作用實際上也就是減小草酸鈣與尿路細胞膜粘附的作用，進而有利于阻斷草酸鈣結石的形成。這個結果表明，胖大海除可以作為清咽利喉藥材外，還可以作為防治草酸鈣結石的藥食兩用藥材。

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