土槿乙酸B體外抗真菌活性及對白色念珠菌麥角甾醇生物合成的影響

劉麗英，陳 虹，高默杰（.中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院檢驗科，天津 3006；.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥學教研室，天津 3006）

土槿乙酸B體外抗真菌活性及對白色念珠菌麥角甾醇生物合成的影響

劉麗英1，陳 虹2，高默杰1（1.中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院檢驗科，天津 300162；2.中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥學教研室，天津 300162）

目的：研究土槿乙酸B（PLAB）的體外抗真菌活性和對白色念珠菌細胞膜中麥角甾醇生物合成的影響。方法：采用微量液體稀釋法研究PLAB的體外抗白色念珠菌、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌的活性。將白色念珠菌經不同濃度PLAB及氟康唑作用28 h后，經過皂化、提取未皂化脂，采用高效液相色譜法測定其麥角甾醇的含量變化。結果：PLAB對白色念珠菌、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌這三株菌株的MIC50分別為16、32、16 μg·mL-1。PLAB能使白色念珠菌中的麥角甾醇含量下降（P ＜0.05），且含量變化呈明顯的劑量依賴性。結論：PLAB具有較強的抗真菌作用，通過抑制真菌的麥角甾醇生物合成而發揮高效抗真菌活性。

土槿乙酸B（PLAB）；高效液相色譜法；白色念珠菌；麥角甾醇

伴隨癌癥、HIV和器官移植患者人數的增加，免疫抑制劑和廣譜抗生素在臨床的大量使用，使得深部真菌感染率已由20世紀50年代的0.3%上升到11.3%，上升了40倍[1]。80%以上AIDS患者受到真菌，尤其是白色念珠菌感染，深部真菌感染已成為許多疾病的主要死亡原因之一。真菌病癥頑固且反復，用藥周期較長，現有的很多藥物因毒副作用較強而使患者用藥依從性差。

土槿乙酸B（pseudolaric acid B，PLAB）是我國松科植物金錢松（pseudolarix raempferi gordon）的根皮及近根皮（土槿皮）中的主要成分之一，為二萜類化合物，天然產物中許多具有此類結構的化合物具有顯著的抗腫瘤作用[2-3]，PLAB還具有顯著的抗真菌活性[4]，目前，對于其抗真菌作用機制的研究較少。本文采用HPLC法測定經PLAB作用前后白色念珠菌細胞膜中麥角甾醇的含量變化，以揭示其對麥角甾醇生物合成的影響，為研究PLAB抗真菌作用的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Millipore純水儀（Millipore公司）；HZQ-X100A型恒溫振蕩培養箱、PH 240型培養箱/干燥箱、SN-CS-2D單人凈化工作臺（上海一恒科學儀器有限公司）；5000 μL、1000 μL加樣槍（法國Gilson公司）；Mettler AE260（梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；P1000高效液相色譜儀（美國熱電公司）；N2000色譜工作站（浙江大學智能信息工程研究所）；CSF-1A超聲發生器（上海超聲波儀器廠）；Phenomenex 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex公司）；臥式矩形壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）。

甲醇（天津市康科德科技有限公司）；石油醚（天津市科銳思精細化工有限公司）；二甲基亞楓（DMSO，天津市百世化工有限公司）；麥角甾醇標準品（美國Sigma公司）；沙保瓊脂培養基、沙保液體培養基（北京奧博星生物技術責任有限公司）；氟康唑注射液（上海信誼藥廠有限公司）。

PLAB，分子量432，乳白色粉末，難溶于水，純度 ＞ 95%，由武警后勤學院生藥學教研室提供，DMSO配制，高壓滅菌備用。

1.2 菌種

白色念珠菌C1a、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌購自中國醫學真菌保藏中心。

1.3 溶液及培養基配制

皂化劑（新鮮配制的含15% NaOH的95%乙醇溶液）；麥角甾醇標準品（0.051 2 g麥角甾醇標準品溶于100 mL甲醇中，超聲波溶解，即為0.512 mg·mL-1麥角甾醇標準品溶液）；YEPD培養基（10%酵母浸粉、20%胰蛋白胨、20%葡萄糖，溶于三蒸水中，高壓滅菌）。

1.4 藥物敏感性實驗

根據美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）制定的M27A方案，體外測定土槿乙酸對白色念珠菌C1a、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌的MIC。

96孔細胞培養板，第1孔加入200 μL RPMI 1640培養液作為空白對照。2 ～ 11孔按藥物濃度遞減的順序加入PLAB溶液100 μL及濃度為5×104cfu·mL-1的菌液100 μL，使PLAB的終濃度分別為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg·mL-1。第12孔加入100 μL RPMI 1640培養液和100 μL菌液作為生長對照。28 ℃培養24 h（絮狀表皮癬菌培養1周）。

1.5 色譜條件

Phenomenex色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:100%甲醇；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長: 210 nm；柱溫:室溫。麥角甾醇在此條件下的保留時間為11.698 min，柱效和峰形良好。

1.6 樣品的制備

取沙氏斜面上活化2 d的白色念珠菌C1a接種于YEPD液體培養基中，30 ℃，150 r·min-1振蕩培養28 h，活化2次，使其處于指數生長期后期[5]。用改良沙堡氏液體培養基調整真菌密度至5×108cfu·mL-1。取此濃度菌液2 mL于250 mL錐形瓶，加YEPD液體培養基98 mL，不同濃度PLAB 100 μL（終濃度分別為0、0.064、0.128、0.256 μg·mL-1），同時以終濃度為0.25 μg·mL-1的氟康唑作為陽性對照組，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養28 h。2000 r·min-1離心10 min，PBS洗滌2次至上清液無色，去上清液，稱各濕菌質量。精密稱取濕菌0.5 g，加PBS 2.5 mL和皂化劑6 mL，混勻，80 ℃水浴皂化60 min。加石油醚（沸程30 ～ 60 ℃）6 mL提取3次，合并提取液，加水6 mL洗滌，醚層于60 ℃水浴揮干，得未皂化脂（nonsaponifiable lipids，NSLs），加甲醇使溶液體積為0.5 mL·g-1濕菌，– 20 ℃保存行HPLC測定。

1.7 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件，比較生長對照組和不同濃度PLAB作用后各試驗組白色念珠菌麥角甾醇含量的差異，評價PLAB對白色念珠菌麥角甾醇生物合成影響的程度，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物敏感性實驗

PLAB對白色念珠菌C1a、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌的MIC50分別為16、32、16 μg·mL-1。

2.2 白色念珠菌樣品中麥角甾醇含量

通過標準品確定了麥角甾醇的峰位（圖1），以標準品峰面積均值為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制出標準曲線[6]。然后對樣品進行HPLC分析（圖2），通過將所得峰面積與標準曲線比較，可以計算出樣品中麥角甾醇的濃度，從而計算出每克濕菌中含有的麥角甾醇微克數。本研究測定了經不同濃度的PLAB及氟康唑作用28 h后每克樣品中的麥角甾醇含量（結果見表1），發現麥角甾醇含量的降低與PLAB濃度呈劑量依賴性關系，各劑量組與對照組及各劑量組之間相比均有明顯的統計學意義（P ＜ 0.05），與陽性對照氟康唑相比也具有很好的相關性，說明PLAB抑制了白色念珠菌麥角甾醇的生物合成。

3 討論

圖1 麥角甾醇標準品的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of standard ergosterol

圖2 PLAB作用28 h后白色念珠菌麥角甾醇含量的HPLC色譜圖A – 0 μg·mL-1PLAB, B – 0.064 μg·mL-1PLAB, C – 0.128 μg·mL-1PLAB, D – 0.256 μg·mL-1PLAB, E – 0.25 μg·mL-1氟康唑Fig 2 HPLC chromatograms of ergosterol in Candida albicans treated with PLAB and fl uconazole for 28 hA – 0 μg·mL-1PLAB, B – 0.064 μg·mL-1PLAB, C – 0.128 μg·mL-1PLAB, D – 0.256 μg·mL-1PLAB, E – 0.25 μg·mL-1fl uconazole

表1 不同濃度PLAB及氟康唑處理后白色念珠菌麥角甾醇的含量. n = 3Tab 1 Ergosterol content in Candida albicans treated with different concentrations of PLAB and fl uconazole. n = 3

真菌細胞膜為液態鑲嵌模型，在排列成雙層結構的磷脂中夾雜有大量的麥角甾醇類化合物，含有較高含量的糖，一些合成甘露聚糖、β-葡聚糖、幾丁質等細胞壁組分所必須的酶也位于細胞膜上。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要成分，通過與磷脂結合穩定磷脂相來增加膜的穩定性。麥角甾醇缺乏以及非平面甾醇前體累積均會導致真菌膜的破裂，麥角甾醇在確保細胞膜結構的完整性、流動性、結合酶的活性、細胞活力以及物質運輸等方面起著重要作用。因此，抑制麥角甾醇的生物合成必將破壞真菌的細胞膜結構，從而起到抗真菌作用。麥角甾醇的生物代謝途徑已成為研究新型抗真菌藥物的重要靶位，臨床上已發現了很多通過抑制麥角甾醇的生物合成來達到抑菌效果的抗真菌藥物[7]，如氟康唑通過抑制P450酶，抑制真菌細胞膜麥角固醇的合成；以兩性霉素B為代表的多烯大環內酯類抗真菌藥物可直接和細胞膜上的麥角甾醇結合，形成抗生素-甾醇復合物，破壞細胞膜的滲透性；以特比萘芬為代表的烯丙胺類抗生素能抑制角鯊烯環氧化酶，引起角鯊烯在質膜上累積，造成膜的損壞。有學者采用HPLC法來測定土壤、植物和藥品等中的麥角甾醇的含量[8]。

本文通過HPLC法測定發現經PLAB作用后白色念珠菌細胞膜中麥角甾醇含量隨著PLAB濃度的增高而呈下降趨勢，且呈一定的劑量依賴性(P ＜ 0.05)，而與陽性對照藥物氟康唑比較的結果也進一步證明PLAB顯著抑制了白色念珠菌中麥角甾醇的生物合成。由于HPLC測定時需要標準品，而羊毛甾醇等其他的中間產物沒有進行測定，且麥角甾醇合成的上游成分角鯊烯應用此法也未能檢測到足以測量的峰位。因此，PLAB到底是作用于麥角甾醇生物合成的哪一個環節，是如何發揮作用，還有待我們進一步研究。

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Antifungal activity of pseudolaric acid B in vitro and its effect on ergosterol biosynthesis in Candida albicans

LIU Li-ying1, CHEN Hong2, GAO Mo-jie1(1. Department of Laboratory Medicine, the Af fi liated Hospital of Medical College of Chinese People′s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; 2. Department of Pharmacy, Logistics University of Chinese People′s Armed Police Force, Tianjin 300162, China)

Objective:To study antifungal activity in vitro and the effect of pseudolaric acid B (PLAB) on ergosterol biosynthesis in the cell membranes of Candida albicans.Methods:Microdilution method was used to determine the susceptibility of fungus (Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Epidermophyton floccosum) to PLAB. The Candida albicans were incubated for 28 h with different concentrations of PLAB and fl uconazole, and the content of ergosterol was detected by HPLC after saponi fi cation and extraction.Results:The MIC50(minimum inhibition concentrations) of PLAB to Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Epidermophyton fl occosum was 16, 32, 16 μg·mL-1respectively. PLAB could decrease the content of ergosterol (P ＜0.05) in Candida albicans with a dose-dependent manner.Conclusion:PLAB had remarkable antifungal activity by inhibiting the ergosterol biosynthesis in fungi.

Pseudolaric acid B (PLAB); HPLC; Candida albicans; Ergosterol

R96

A

1672 – 8157(2014)02 – 0085 – 04

2013-12-04

2014-01-14）

國家自然科學基金資助項目（30171108）

陳虹，女，博士生導師，教授，研究方向:天然產物的活性成分研究。E-mail:chenhongtian@yahoo.com.cn

劉麗英，女，主管技師，講師，研究方向:藥物對真菌的影響。E-mail:lly0981556@126.com