HPLC法測定人血清中萬古霉素及去甲萬古霉素濃度及臨床應用

黃曉會，劉　艷，張　健（上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092）

HPLC法測定人血清中萬古霉素及去甲萬古霉素濃度及臨床應用

黃曉會，劉艷，張健（上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092）

目的：建立同時測定血清中萬古霉素及去甲萬古霉素濃度的高效液相色譜法。方法：采用Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；二極管陣列檢測。內標法定量，萬古霉素與去甲萬古霉素互為內標。結果：去甲萬古霉素低、中、高3個濃度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分別為98.5%、102.2%、103.1%，萬古霉素低、中、高3個濃度（3.125、25.000、50.000 μg·mL-1）的方法回收率分別為96.2%、100.8%、103.5%，日內精密度RSD小于3.24%，日間精密度RSD小于6.12%。結論：本方法準確度高，靈敏度好，操作簡便，符合萬古霉素及去甲萬古霉素血藥濃度監測和藥代動力學研究的要求。

萬古霉素；去甲萬古霉素；高效液相色譜法

萬古霉素（vancomycin）屬于三環糖肽類抗菌藥物，臨床上主要用于敏感革蘭陽性菌，特別是嚴重耐藥的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致心內膜炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病，全球僅9株金黃色葡萄球菌耐藥，被譽為抗生素最后一道防線。其具有一定的抗生素后效應，為時間依賴性抗菌藥物，并且具有耳、腎毒性和血栓性靜脈炎等嚴重不良反應，臨床應用時常需進行血藥濃度監測，并及時調整給藥方案。本實驗參考現有文獻[1-9]報道的9種HPLC法測定血清中萬古霉素與去甲萬古霉素的方法，對比其前處理方法與色譜條件，對沉淀蛋白劑進行優化分析、驗證，最終建立了一種較為精確、快速、實用的萬古霉素及去甲萬古霉素的測定方法，并應用于本院血藥濃度監測。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥

1260高效液相色譜儀（包括G1367E自動進樣器、G1311B四元泵、G4212B二極管陣列檢測器，美國Agilent公司）；Milli-Q純水器（Millipore公司）；Vortex KB3型旋渦混懸器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5424R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。萬古霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130329-200501）；去甲萬古霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130359-200503）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸、磷酸二氫鉀、三氯醋酸、硫酸鋅均為分析純。

1.2溶液的配制

1）標準儲備液:精密稱取萬古霉素對照品和去甲萬古霉素對照品各20 mg，用水定容至5 mL的容量瓶中，配成質量濃度為4000 μg·mL-1的對照品工作液。2）磷酸二氫鉀緩沖液:精密稱取磷酸二氫鉀6.805 g，用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸調節pH值至3.2，配制成0.05 mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液。

1.3實驗方法

1.3.1色譜條件色譜柱:Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（pH = 3.2）（7.5∶92.5）；流速:1 mL·min-1；檢測波長:236 nm；進樣量:25 μL；柱溫:30 ℃。

1.3.2樣品預處理精密取待測人血清樣品200 μL于1.5 mL Eppendorf管中，加入內標（萬古霉素或去甲萬古霉素）溶液200 μL（12.5 mg·mL-1），加入4%的硫酸鋅溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣分析。

1.3.3標準曲線的制備精密量取血清900 μL，加入4000 μg·mL-1的萬古霉素/去甲萬物霉素標準品儲備液100 μL，配制成400 μg·mL-1的溶液，依次用空白血清稀釋成100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.562 5 μg·mL-1的血清標本，同時稀釋得低、中、高3種濃度的質控血清標本，使其濃度分別為3.125、25.000、50.000 μg·mL-1。

2　結果

2.1色譜分離結果

在“1.3.1”項色譜條件下，萬古霉素與去甲萬古霉素分離完全，血中內源性物質對測定結果無干擾，見圖1。

2.2標準曲線

測定標準曲線樣本，以去甲萬古霉素/萬古霉素的峰面積為縱坐標，樣本濃度為橫坐標進行線性回歸。結果顯示:去甲萬古霉素與萬古霉素均在1.562 5 ～100.000 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。去甲萬古霉素的線性方程為:Y = 0.099 8 X – 0.056 7，r = 0.999 8；萬古霉素的線性方程為:Y = 0.097 3X – 0.346，r = 0.996 4。根據標準曲線，本方法中去甲萬古霉素與萬古霉素的定量限均為1.562 5 μg·mL-1。

圖1　萬古霉素與去甲萬古霉素血清色譜圖1 –去甲萬古霉素，2 –萬古霉素Fig 1　HPLC chromatogram of vancomycin and norvancomycin in serum1 – norvancomycin; 2 – vancomycin

2.3方法回收率與精密度實驗

分別測定低、中、高3個濃度水平的血清質控標本各5組，計算方法回收率和日內精密度（RSD）；連續測定5日，計算日間精密度。日內、日間精密度均小于7%，見表1。

表1　測定血清中萬古霉素與去甲萬古霉素的方法回收率、精密度結果. n = 5Tab 1　Results of the recovery rates and precision of vancomycin and norvancomycin in serum. n = 5

2.4穩定性實驗

取低、中、高濃度各3個平行樣品，按“1.3.2”項下處理后，將上清液在室溫分別放置4、24、48 h后重復測定，計算變異系數（CV%）；將配置好的血清質控標本置于– 4 ℃冰箱分裝保存，每隔1周復測1次，3個水平分別測3組平行樣品，計算CV%。結果顯示，去甲萬古霉素和萬古霉素的血清標本在上述情況下穩定性良好，測定值CV% ＜ 10%。

2.5臨床應用

采用本方法為2013年1 – 10月本院及外來的61例重癥感染患者進行萬古霉素或去甲萬古霉素的血藥濃度監測，其中萬古霉素57例，去甲萬古霉素4例，萬古霉素測定峰濃度共28例，谷濃度共29例，去甲萬古霉素峰谷濃度各2例。由于去甲萬古霉素監測較少，故此只對萬古霉素監測結果進行分析，其中9例患者血清谷濃度低于10 μg·mL-1，17例患者谷濃度在10 ～ 20 μg·mL-1之間，只有3例大于20 μg·mL-1，根據《萬古霉素臨床應用中國專家共識（2011版）》，萬古霉素血藥谷濃度臨床上應控制在10 ～ 20 μg·mL-1，嚴重感染患者血藥谷濃度應控制在15 ～ 20 μg·mL-1，至少要保持在10 μg·mL-1以上，以免發生耐藥。根據檢測結果，并結合患者實際情況，對藥物的用量做了適當調整。血藥濃度監測結果說明萬古霉素在患者中具有較大個體差異，對其進行血藥濃度監測非常重要。

3　討論

3.1前處理條件的優化

血樣處理方法的選擇直接影響HPLC的應用效果，萬古霉素與去甲萬古霉素血樣處理方法常用的有固相萃取法和直接沉淀法，前者較為繁瑣，后者較為簡便、省時，但有些蛋白沉淀劑并不能達到理想效果。目前，關于萬古霉素血藥濃度的HPLC測定方法國內外均有報道[1-6]，考慮萬古霉素和去甲萬古霉素性質等各方面的因素，初步選擇乙腈、甲醇、10%硫酸鋅、20%硫酸鋅、30%硫酸鋅、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）常用沉淀提取劑進行前處理優化。結果顯示，單從外觀方面，乙腈、甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）凈化效果較好，10%硫酸鋅、20%硫酸鋅、30%硫酸鋅常溫條件下離心后，會出現肉眼可見的渾濁，但是10%硫酸鋅凈化效果明顯好于20%硫酸鋅以及30%硫酸鋅，故并非硫酸鋅用量越多凈化越好。從進樣回收率方面，乙腈的回收率幾乎為0，甲醇、高氯酸、6%高氯酸、乙腈- 6%高氯酸（1∶6）在60%左右，而用硫酸鋅凈化的回收率均在90%以上，故選用硫酸鋅做沉淀提取劑。

進一步研究硫酸鋅與血清的比例，以達到最優進化效果。前處理體系為200 μL血清+ 200 μL內標+100 μL沉淀提取劑，故配制2%硫酸鋅、5%硫酸鋅、10%硫酸鋅進行優化對比，結果顯示5%的硫酸鋅凈化效果最好，回收率最高，即硫酸鋅沉淀提取劑與血清的配比應為:每毫升血清需加入0.25 g的硫酸鋅。由于各方法的前處理體系并不相同，故需要的蛋白沉淀劑劑量也不相同，檢測者可根據所監測的血樣，按照實際應用換算需要加入沉淀劑的量，不局限于本體系，還適用與各種體系，使檢測者換算更方便，準確。

3.2萬古霉素監測的必要性

不恰當的抗菌藥物治療方案不僅會延長患者住院時間，甚至使臨床治療喪失應有的效果，且容易誘導耐藥菌的產生，而恰當的治療方案除了選擇正確的抗菌藥物外，合適的劑量和給藥間隔也至關重要[7]。有文獻[9]報道預防用藥的不合理比例明顯高于治療用藥。本次監測57例萬古霉素患者，單獨使用萬古霉素僅13例，聯用一種抗感染藥物21例，聯用兩種抗感染藥物16例，聯用三種抗感染藥物7例；在所有與萬古霉素聯用的抗感染藥物中，主要有美羅培南、亞胺培南、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、頭孢吡肟、利尿劑等，其中用于治療用藥為90.75%，預防用藥為9.25%，用藥相對合理。

應根據藥代動力學個體化調整萬古霉素的劑量和實現目標血藥濃度監測。推薦通過血藥谷濃度進行劑量調整，新生兒保持谷濃度在5 μg·mL-1以上，成人則推薦為15 ～ 20 μg·mL-1。國家衛生部《二、三級綜合醫院藥學部門基本標準》（衛醫政發[2010]99號）中，將血藥濃度監測設備列為二級以上醫院藥劑科“至少應當配備”的基本設備之一。僅通過藥品說明書和醫師經驗給藥，很難使血藥濃度達到目標范圍，必須借助血藥濃度監測來實施精細調控。綜合患者的實際情況給出用藥建議，減少不合理處方，降低不良反應的發生。

[1]宋新文，許瓊，汪洋，等.HPLC法測定人血清中萬古霉素的濃度[J].中國藥房，2010，21（18）:1663-1665.

[2]林秀麗，朱金平，費燕.HPLC法快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國臨床藥學雜志，2011，20（4）:231-234.

[3]崔艷麗，武峰.HPLC法同時快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J].中國醫院用藥評價與分析，2011，11（10）: 920-922.

[4]彭芳辰，李穎，白小紅.高效液相色譜法測定人血清中萬古霉素的濃度[J].中國藥物與臨床，2011，11（6）:667-668.

[5]張文娟，宋新文，汪洋，等.固相萃取高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J].中國臨床藥理學雜志，2011，27（2）:149-151.

[6]羅奕，劉文，鄧楠，等.萬古霉素血藥濃度監測方法的建立及穩定性考察[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（20）:133-135.

[7]石秀錦，蔡郁，魏國義，等.64例老年患者萬古霉素血藥濃度監測結果分析[J].中國藥物應用與監測，2012，9（3）:129-132，135.

[8]廖曉玲，何秋香，梁蘊賢.69例使用萬古霉素類藥物患者的病例調查分析[J].中國藥物應用與監測，2011，8（4）:224-228.

[9]郭代紅，史麗敏，李嘉靜，等.831例萬古霉素類藥物利用分析[J].中國藥物應用與監測，2004，1（1）:55-57.

Concentration determination of vancomycin and norvancomycin by HPLC as well as its clinical application

HUANG Xiao-hui, LIU Yan, ZHANG Jian(Department of Pharmacy, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective:To establish the HPLC method for fast, effective, simultaneous determination of vancomycin and norvancomycin in serum.Methods:The extract was separated by Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate buffer solution (pH = 3.2) (7.5∶92.5) with the fl ow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was set at 236 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 25 μL. Vancomycin and norvancomycin were used as the internal standard for each other.Results:For norvancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 98.5%, 102.2%, and 103.1% respectively. For vancomycin, the average method recovery rates of three concentrations (3.125, 25.000, 50.000 μg·mL-1) were 96.2%, 100.8% and 103.5% respectively. The within-day RSD was less than 3.24%, and between-day RSD was less than 6.12%.Conclusion:The method was accurate, sensitive, simple, which was suitable for the therapeutic drug monitoring (TDM) and pharmacokinetic study of vancomycin as well as norvancomycin.

Vancomycin; Norvancomycin; HPLC

R917

A

1672 – 8157(2014)02 – 0092 – 03

2013-11-11

2014-01-14）

國家自然科學基金青年基金（81202598）；上海市高校青年教師培養資助基金（ZZjdyx13091）

張健，男，主任藥師，碩士研究生導師，主要從事臨床藥學與臨床藥理工作。E-mail:zj_boss@126.com

黃曉會，女，藥師，主要從事臨床藥理學工作。E-mail:huangdi456@126.com