過表達IDO骨髓間充質干細胞分泌外泌體通過不同分子軸調節DC及T細胞

劉星佑 陳鑫昊 黃尹霞 李敏 撒亞蓮 賀繼剛

1云南中醫藥大學（昆明650000）；2云南省第一人民醫院心臟大血管外科（昆明650000）

20 世紀以來，世界范圍內隨著人口老齡化、缺血性心臟病、糖尿病和肥胖等危險因素的增加，心力衰竭（heart failure，HF）的發病率不斷上升［1］。據統計，全球成年人中約有2 600 萬心力衰竭患者，盡管已有治療心力衰竭的一些方法出現，如藥物治療、雙心室起搏、左心室輔助裝置和全人工心臟，但心臟移植仍是治療終末期心力衰竭的“黃金標準”，也是提高終末期心力衰竭患者生存率和生活質量的有效途徑［2］。而器官排異反應是影響移植器官存活的主要問題。目前研究認為間充質干細胞的旁分泌是間充質干細胞完成其生物功能的重要機制［3-4］。課題組前期已經證明過表達吲哚胺2，3 雙加氧酶（indoleaminae 2，3-dioxygenase，IDO）的骨髓間充質細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）分泌的外泌體（exosome）即BMSCIDO-exosome 可以有效抑制免疫排斥反應［5-6］并發現BMSCIDO-exosome 中miRNA-540-3p 表達明顯增高且差異具有統計學意義，其功能涉及抗免疫排斥反應，可能是抑制免疫排斥反應的關鍵分子。筆者采用靶基因預測數據庫、PCR、Western blot（WB）及雙熒光素酶的方法證實miRNA-540-3p對應的靶基因為CD74，進而采用Western blot 的方法對CD74 下游的p-ERK1/2、p-p65、p-AKT 的表達進行檢測。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑定量PCR 儀購自美國Light-Cycle 96；紫外分光光度計購自美國NanoDropND-1000；凝膠成像儀、垂直電泳槽、濕式轉膜槽均購自BIO-RAD；CD74 抗體購自abcam ab202844（批號：GR3206250-17 有效期至2022年9月）；CD28 抗體購自abcam ab243228（批號：GR3277276-3 有效期至2022年9月）；CCL4 抗體購自abcam ab25129（批號：GR189200-6 有效期至2021年9月）；p-p65抗體購自abcam ab86299（批號：GR3204852-21 有效期至2022年9月）；p-ERK1/2 賽默飛MA5-15174（批號：BA 06044196 有效期至2022年9月）；引物合成來自廣州invitrogen；exosome 提取試劑盒購自銳博（批號U0122 有限期至2022年3月）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立按照文獻［3］建立過表達IDO 大鼠骨髓間充質干細胞并提取外泌體、對照組分泌的外泌體，以及大鼠DC 細胞、T 細胞。

1.2.2 共培養及分組與DC 細胞共培養實驗分為5 組（每組6 例）：A，DC 組；B，DC+脂多糖（LPS）組；C，BMSC-exosome+DC+LPS 組；D，BMSC空載體-exosome+DC+LPS 組；E，BMSCIDO-exosome+DC+LPS 組。與T 細胞共培養實驗分為5 組（每組6 例）：F，T 組；G，T+脂多糖（LPS）組；H，BMSC-exosome+T+LPS組；I，BMSC空載體-exosome+T+LPS 組；J，BMSCIDO-exosome+T+LPS 組。48 h 后采用流式細胞儀檢測共培養組DC 細胞及T 細胞內的miR-540-3p 的表達情況。采用WB 檢測共培養DC 細胞及T 細胞內CD74、CD28、CCL4、p-ERK1/2、p-p65 及p-AKT 表達情況。

1.2.3 采用RT-PCR 檢測共培養48 h A-J 組中miR-540-3p 表達量應用beacon designer 7.90 設計Q-PCR 引物，引物序列如下：U6：5'GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'（forward）5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'（reverse）；miR-540-3p：5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGCCCAGG3'（RTprimer），5'GGAGGTCAGAGGTCGATC3'（gene-specific stem-loop primer）。完成總RNA提取，反轉錄為cDNA，完成目的基因擴增（95 ℃，10 min；95 ℃，2 s；60 ℃，20 s；70 ℃，10 s 共完成45 ～50 個循環）。收集信息，做Ct 值分析。

1.2.4 Western blot采用Western blot 實驗檢測共培養48 h DC 細胞及T 細胞內CD74、CD28、CCL4、p-ERK1/2、p-p65 及p-AKT 表達情況。

1.3 統計學方法使用SPSS 15.0 軟件進行統計分析。數據以（）表示。各組（每組6 例樣本）間比較采用單因素方差分析，所有分組經檢測均為正態分布。所有統計假設檢驗均為雙側的。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 與DC細胞共培養48 h后DC細胞中miR-540-3p 的表達量各exosome 與DC 細胞共培養48 h 后采用RT-PCR 方法檢測DC 細胞中miR-540-3p 的表達量，可見，BMSCIDO-exosome+DC+LPS 組DC 細胞內miR-540-3p 表達量最高。見圖1。

圖1 不同BMSCs 細胞分泌外泌體與DC 細胞共培養48 hFig.1 Different BMSCs secreted exosomes and co cultured with DC cells for 48 hours

2.2 與T 細胞共培養48 h 后T 細胞中miR-540-3p的表達量各exosome 與T 細胞共培養48 h 后采用RT-PCR 方法檢測T 細胞中miR-540-3p 的表達量，可見BMSCIDO-exosome+T+LPS 組T 細胞內miR-540-3p 表達量最高。見圖2。

圖2 不同BMSCs 細胞分泌外泌體與T 細胞共培養48 hFig.2 Different BMSCs secreted exosomes and co cultured with T cells for 48 hours

2.3 與DC 細胞共培養48 h 后，DC 細胞內CD74、CD28、CCL4 的表達量采用Western blot 檢測BMSCIDO-exosome與DC細胞共培養48 h后，DC細胞內CD74、CD28、CCL4的表達量，可見BMSCIDO-exosome+DC 細胞培養組中CD74、表達較其它對照組明顯降低，CD28 及CCL4 表達未見規律性變化（圖3）。

圖3 Western blot 檢測DC 細胞中miRNA-540-3p 靶基因蛋白CD74、CD28、CCL4 的表達Fig.3 The expression of miRNA-540-3P target gene proteins CD74，CD28 and CCL4 in DC cells was detected by Western blot

2.4 與T細胞共培養48 h后，T細胞內CD74、CD28、CCL4 的表達量采用Western blot 檢測BMSCIDOexosome 與T 細胞共培養48 h 后，T 細胞內CD74、CD28、CCL4 的表達量。可見BMSCIDO-exosome+T 細胞共培養組中T 細胞內的CD74 表達明顯降低，CD28 及CCL4 無規律性表達（圖4）。

圖4 Western blot 檢測T 細胞中miRNA-540-3p 靶基因蛋白CD74、CD28、CCL4 的表達Fig.4 The expression of miRNA-540-3P target gene proteins CD74，CD28 and CCL4 in T cells was detected by Western blot

2.5 雙熒光素酶報告CD74 基因與miRNA-540-3p 的靶向結合力使用psi-check 雙熒光素酶報告基因質粒系統，檢測CD74 基因與miRNA-540-3p的靶向結合力，可見miRNA-540-3p 與CD74 基因具有靶向結合能力（圖5）。

圖5 雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-540-3p 與CD74 基因具有靶向結合能力Fig.5 Double luciferase reporter gene verifies that miRNA-540-3P has targeted binding ability with CD74 gene

2.6 與DC細胞共培養48 h后DC細胞內p-NF-κB（p-p65）、p-ERK1/2、p-AKT 蛋白的表達采用Western blot 檢測BMSCIDO-exosome 與DC 細胞共培養48 h 后DC 細胞內p-NF-κB（p-p65）、p-ERK1/2、p-AKT 蛋白的表達，可見BMSCIDO-exosome+DC 細胞培養組中p-p65 表達明顯降低，p-ERK1/2、p-AKT表達未見規律性變化（圖6）。

圖6 Western blot 檢測DC 細胞中下游蛋白p-p65、p-ERK1/2、p-AKT 的表達Fig.6 Expression of p-P65，P-ERK1/2 and P-Akt in the middle and lower reaches of DC cells were detected by Western blot

2.7 與T 細胞共培養48 h 后T 細胞內p-NF-κB（p-p65）、p-ERK1/2、p-AKT 蛋白的表達量采用Western blot 檢測BMSCIDO-exosome 與T 細胞共培養48 h后T細胞內p-NF-κB（p-p65）、p-ERK1/2、p-AKT蛋白的表達，可見BMSCIDO-exosome+T 細胞共培養組中T 細胞內的p-AKT 表達明顯降低，p-NF-κB（p-p65）、p-ERK1/2 無規律性表達（圖7）。

圖7 Western blot 檢測T 細胞中下游蛋白p-p65、p-ERK1/2、p-AKT 的表達Fig.7 Expression of p-P65，P-ERK1/2 and P-Akt in the middle and lower reaches of T cells were detected by Western blot

3 討論

器官移植是治療終末衰竭器官的一種有效方法，但由于免疫排異反應及昂貴的免疫抑制劑使得該項技術發展非常緩慢。基于此，實驗前期已經證實過表達IDO 基因的SD 大鼠骨髓間充質干細胞分泌的外泌體（BMSCIDO-exosome）可以有效抑制免疫排斥反應［3-4］。在此基礎上本研究通過RTPCR 發現與BMSCIDO-exosome 共培養48 h 后SD 大鼠DC 細胞、T 細胞內miRNA-540-3p 表達明顯增高且差異具有統計學意義，其功能涉及抗免疫排斥反應，可能是抑制免疫排斥反應的關鍵分子。

miRNA-540-3p 是一類研究不多的microRNA。人的PPARα，ACOX1，CPT1A，ABCD3 和PPARδ（過氧化物酶體增殖劑激活受體-δ）的3'UTR 靶標相同的種子序列的hsa-miR-6801 被鑒定為miRNA-540-3p 功能等同物［7］。據SUDHIR 等［8］報道：肝再生增強蛋白缺乏癥可以通過誘導氧化應激和microRNA-540-3p 表達促進肝脂肪變性。目前國、內外未見miRNA-540-3p 與免疫調節的相關報道。

目前已知miRNA 可以有多個對應的靶基因，其通過下調靶基因蛋白的表達，影響受體細胞的生物學功能。進而課題組采用12 個miRNA 靶基因預測數據庫（miRWalk、Microt4、miRanda、mirbridge、miRDB、miRMap、miRNAMap、Pictar2、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan）對miRNA-540-3p的靶基因進行預測（篩選條件：同一個靶基因必須被≥10 個數據庫檢索到，同時靶基因與miRNA 的匹和度≥8），可見miRNA-540-3p 對應的靶基因為CD74、CD28 和CCL4。進一步通過Western blot 檢測證實，在體外與BMSCIDO-exosome 共培養的DC 細胞、T 細胞內CD74 蛋白表達明顯減少。通過雙熒光素酶報告基因實驗證明miRNA-540-3p 與CD74基因具有靶向結合能力。

CD74 是一種具有Ⅱ型拓撲結構的跨膜蛋白，其在抗原呈遞中的作用已得到廣泛的研究［9］。目前研究認為CD74 是MHCⅡ（如DC 細胞，B 細胞和巨噬細胞）抗原呈遞細胞中參與抗原呈遞最強分子之一［10］。最近發現CD74 不僅對MHCⅡ抗原呈遞途徑很重要，而且對交叉表達的病毒MHCⅠ類抗原呈遞途徑也有重要意義。在缺乏CD74 的情況下，DC 細胞的交叉啟動能力明顯受損，因為MHCⅠ類（MHCⅠ）復合物不能有效地靶向于內源性溶酶體區。CD74 對DC 細胞遷移的影響在體內也得到證實，并且在其它表達CD74 的細胞如B 淋巴細胞中也是有效的。CD74 的胞質N 末端結構域可介導這些效應。CD74 在DC 細胞和B 細胞中與肌球蛋白Ⅱ相互作用，肌球蛋白Ⅱ是一種參與DC 細胞遷移的運動蛋白。在CD74 缺陷的DC 細胞中，內吞囊泡的數量顯著增加，但它們的體積明顯縮小［11］。另外，據報道CD74 受體可以與MIF2（巨噬細胞遷移抑制因子2）形成復合物，兩者形成復合物可啟動下游信號通路（ERK1/2）NF-κB、PI3K/AKT［12-14］。

本研究進一步采用Western blot 檢測與BMSCIDOexosome 共培養48 h 后DC 細胞、T 細胞內的ERK1/2、NF-κB、AKT 的表達，可見在DC 細胞中p-NF-κB（p-p65）的表達呈規律性下降，具有顯著性差異，雖然ERK1/2、AKT 在BMSCIDO-exosome 共培養48 h后DC 細胞中也有下降。但在BMSC-exosome 與BMSC空載體-exosome 比較中，其差異也有統計學意義，所以不能排除是由于載體引起的ERK1/2、AKT的變化。在與BMSCIDO-exosome共培養48 h后T細胞中p-AKT 的表達呈規律性下降，具有顯著性差異。雖然ERK1/2、p-NF-κB（p-p65）在BMSCIDO-exosome共培養48 h 后T 細胞中也有下降。但在BMSCexosome 與BMSC空載體-exosome 比較中，其差異也有統計學意義，所以不能排除是由于載體引起的ERK1/2、p-NF-κB（p-p65）的變化。

NF-κB 信號通路：NF-κB/Rel 蛋白包括NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/plo5、c-Rel、RelA/p65、RelB。這些蛋白均形成二聚體轉錄因子，它們控制的基因調控眾多的生物學過程如先天性和獲得性免疫、炎癥、應激反應、B 細胞形成、淋巴器官的生成。在細胞炎癥反應、免疫應答等過程中NF-κB起到關鍵性作用。NF-κB 的錯誤調節會引發自身免疫病、慢性炎癥以及很多癌癥［15］。

Akt 網絡的關鍵要素之一是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。當免疫系統錯誤地將自身組織識別為異物并觸發免疫反應時，就會發生自身免疫性疾病。免疫系統的自身反應性是多因素的，可能導致致病性自身免疫和相關的自身免疫性疾病［16］。盡管自身免疫性疾病發病機理的確切機制尚不清楚，但T 細胞、B 細胞和髓系細胞的過度激活和功能異常已被廣泛研究［17］。

綜上所述：BMSCIDO-exosome 通過miRNA-540-3p（+）/CD74（-）/p-p65（-）分子軸抑制DC 細胞的激活，通過miRNA-540-3p（+）/CD74（-）/p-AKT（-）分子軸抑制T 細胞的激活，從而抑制免疫反應。