傳統豆醬中脂肪酸酯化方法的選擇與組成分析

田 甜，武俊瑞，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

傳統豆醬中脂肪酸酯化方法的選擇與組成分析

田 甜，武俊瑞，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

為更好地研究傳統豆醬中脂肪酸的組成，先用索氏提取法提取豆醬中的脂肪酸，分別利用酸酯化法、堿酯化法和酸堿酯化法對脂肪酸進行甲酯化，正己烷萃取后，采用氣相色譜-質譜法檢測，根據標準譜庫NIST11.L，結合有機質譜學規律對脂肪酸甲酯進行定性分析，并用面積歸一化法測定其相對含量。結果表明：衍生化后，脂肪酸甲酯在33 min內完全分離，利用酸酯化法可分析出10 種脂肪酸，其中含量較高的物質有棕櫚酸甲酯13.62%、油酸甲酯23.95%、亞油酸甲酯48.91%；利用堿酯化法可分析出4 種脂肪酸，其中含量較高的物質有油酸甲酯10.42%、亞油酸甲酯19.63%；利用酸堿酯化法可分析出10 種脂肪酸，其中含量較高的物質有棕櫚酸甲酯13.64%、油酸甲酯24.16%、亞油酸甲酯49.07%。本方法無需標準品 即可快速定性檢測豆醬中的脂肪酸，結果準確、可靠。

傳統豆醬；脂肪酸；甲酯化；氣相色譜-質譜法

東北傳統豆醬是以大豆為主要原料，經自然發酵而成的半流動狀態的發酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大醬[1]。脂肪酸不僅作為豆醬中的營養成分，更是豆醬風味形成的前體物質[2]，因此研究豆醬中脂肪酸的種類和數量具有重要意義。

脂肪酸沸點高、極性強，是一種熱敏性物質，在高溫條件下易發生聚合、脫酸、裂解等副反應，因此，氣相色譜分析之前一般都將脂肪酸甲酯化。目前國內外已報道的脂肪酸甲酯化方法有重氮甲烷法、BF3-甲醇法[3]、季銨鹽法、酸催化和堿催化法等。但相比之下，重氮甲烷法易 使雙鍵結構發生變化，影響甲酯化率。季銨鹽法由于強堿和高溫條件，常引起多不飽和脂肪酸發生異構化和降解現象。BF3-甲醇法雖然甲酯化速度快，但試劑昂貴，并且有毒性[4]。因此本實驗采用酸酯化法、堿酯化

法和酸堿酯化法對脂肪酸進行甲酯化，意在確定一種安全有效，甲酯化率高的方法。

氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術具有方便、準確、快捷的特點，避免標樣對檢測結果的限制，有利于新化合物的發現[5]，現已成為一種國際通用的油脂脂肪酸測定方法[6]，因此運用GC-MS聯用技術研究傳統豆醬中脂肪酸的組成和數量，可以很好的了解傳統豆醬的營養價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統豆醬 實驗室自制。

石油醚、乙醚、乙酸乙酯、硫酸、甲醇、氯化鈉、氫氧化鉀、鹽酸（均為分析純），正己烷（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；所有實驗用水均取自Milli2Q系統。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；XS2002S分析天平 瑞士Mettle-Toledo公司；N1000系列旋轉蒸發儀 日本Eyela公司；Milli-Q Synthesis超純水系統 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗室自制傳統豆醬工藝

大豆→凈化→蒸煮→研碎→制醬塊→自然接種、發酵3 個月→水洗、分割→下醬→曬醬→打靶→成熟

豆醬成熟參數：pH 6.13～6.15；總酸0.58～0.60 g/100 mL；水分質量分數68%～73%；氨基酸態氮0.37 ～0.39 g/100 mL；可溶性糖0.31～0.32 g/100 g；粗蛋白質量分數23.05%～23.11%。

1.3.2 豆醬中粗脂肪提取

取豆醬50 g，放入90 ℃烘箱中干燥3 h，然后研磨過80 目篩子得到豆醬干粉。取豆醬干粉8 g裝于一個濾紙筒內，置于索氏抽提器中，加入350 mL有機溶劑水浴提取8 h，提取結束后，將提取液加入旋轉蒸發器中進行蒸餾，全部溶劑蒸出后即得到豆醬粗油[7]。

1.3.3 脂肪酸甲酯化

1.3.3.1 酸酯化法

取油樣0.3 g，加入體積分數3%硫酸-甲醇溶液4 mL，60 ℃ 水浴酯化30 min，冷卻后轉入100 mL分液漏斗，加入 2 mL正己烷，加入2 mL飽和氯化鈉溶液振搖，靜置分層后收集有機相于25 mL容量瓶，水相連續用4 mL正己烷萃取2 次，收集有機相并入25 mL容量瓶，正己烷稀釋至刻度[8]。

1.3.3.2 堿酯化法

取油樣0.3 g，加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液8 mL，于60 ℃水 浴中皂化20 min至無油，冷卻到室溫，加2 mL蒸餾水，混合均勻后用2 mol/L的鹽酸調節pH值至3～4，用4 mL正己烷萃取，水相連續用4 mL正己烷萃取2 次，收集有機相并入25 mL容量瓶，正己烷稀釋至刻度[9]。

1.3.3.3 酸堿酯化法

取油樣0.3 g，加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液8 mL，于60 ℃水浴中皂化20 min至無油，滴加體積分數50%硫酸（以濃硫酸為基準）調pH值至中性，再加入4 mL硫酸-甲醇（12.5%，V/V）溶液，酯化反應30 min，加入5 mL正己烷，振搖，加入2 mL飽和氯化鈉溶液鹽析，分液漏斗萃取，收集有機相于25 mL容量瓶中，水相用正己烷4 mL萃取2 次，收集有機相并入25 mL容量瓶，正己烷稀釋至刻度[10]。

1.3.4 氣相色譜條件

石英毛細管柱DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱初溫60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，整個分析過程33 min；載氣He，柱流量1.0 mL/min；分流比50∶1；進樣口溫度250 ℃；進樣量1.0 μL。

1.3.5 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；進樣口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；劑延遲時間5 min；掃描方式：全離子掃描；質量掃描范圍m/z 50～550。

1.3.6 脂肪酸甲酯質譜特征

根據脂肪酸甲酯的總離子流圖和質譜圖對豆醬中的脂肪酸甲酯進行定性分析。根據總離子流圖的保留時間確定脂肪酸的分離情況；根據質譜圖中基峰離子和分子離子的質荷比確定脂肪酸甲酯的雙鍵數目和碳原子數；根據γ氫遷移、麥氏重排等有機質譜學規律確定脂肪酸甲酯中離子的斷裂規律，從而對脂肪酸甲酯進行定性分析。

1.3.7 定性定量分析

用GC-MS進行全離子掃描分析，得GC-MS總離子流圖；用化學工作站數據處理系統NIST11.L譜圖庫進行譜圖解析并結合人工分析質譜圖，確認其化學成分；用面積歸一化法定量計算豆醬中各脂肪酸的相對含量[11]。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸甲酯質譜特征

2.1.1 飽和脂肪酸甲酯質譜特征

目前脂肪酸定性一般需要將標準品與樣品在相同色譜條件下進樣分析，通過與標準脂肪酸甲酯的保留時間進行比較，確定樣品中脂肪酸甲酯的組成[12]，但這造成

價格昂貴的標準品在不同實驗條件下重復使用，因此本實驗根據GC-MS標準質譜數據庫檢索，結合有機質譜學規律對脂肪酸定性，在節約標準品的同時，保證了實驗的準確性。

直鏈飽和脂肪酸的質譜規律較為簡單，易于準確識別。根據有機質譜學規律，直鏈飽和脂肪酸甲酯通過γ氫遷移和麥氏重排，使C2-C3鍵斷裂，γ氫通過六元環過渡態轉移到羰基氧而產生碎片離子［CH3-O-C(OH)=CH2］+（m/z 74），該離子為直鏈飽和脂肪酸甲酯的基峰離子[13-14]，其經歷置換反應可產生m/z 87離子，并且m/z 87處的質譜峰的相對強度明顯高于除基峰外的其他特征離子[12]。一般分子離子峰會出現，并伴有[M-43]+、[M-31]+和[M-29]+等碎片離子[12]。因此運用質譜中基峰，高強度峰和分子離子峰的質荷比可以確定樣品中的飽和脂肪酸甲酯。支鏈飽和脂肪酸甲酯在甲基支鏈處易發生斷裂，產生相差[-CH(OH3)-]的2個較強的碎片離子，離子質荷比相差28，因此可根據28規律判斷甲基支鏈在碳鏈中所處的位置[15]，同時結合分子離子以及麥氏重排離子等特征離子可以準確鑒定支鏈飽和脂肪酸，見圖1。

圖1 豆醬中9-甲基十四烷酸甲酯質譜圖Fig.1 Mass spectrum of 9-methy-tetradecanoic acid methyl esters for soybean paste

如圖1所示，脂肪酸甲酯的分子離子質荷比為256，據此可確定脂肪酸的碳原子數目為15，質譜圖中存在離子強度較大的離子m/z 185和m/z 213，二者質荷比相差28，如此可得出甲基支鏈位于脂肪酸的C9上，同時根據基峰離子m/z 74可以確定其為飽和脂肪酸，因此該物質為9-甲基十四烷酸甲酯。

2.1.2 單不飽和脂肪酸甲酯質譜特征

單不飽和脂肪酸的分子離子通過γ氫轉移、i誘導斷裂產生[M-32]+離子。雙鍵遷移發生α斷裂產生C4H7+離子m/z 55，該離子為單不飽和脂肪酸的基峰離子，因此可根據特征離子m/z 55、[M-32]+和分子離子來確定單不飽和脂肪酸的種類[13]。雙鍵位置不同的異構體，質譜圖相同，這是因為雙鍵有相似的活動性[12-13]，見圖2。

如圖2所示，脂肪酸甲酯的分子離子質荷比為296，據此可確定脂肪酸的碳原子數目為18，分子離子通過γ氫轉移、i誘導斷裂產生[M-32]+離子m/z 264，雙鍵遷移發生α斷裂產生C4H7+離子m/z 55，由此可知其含有一個不飽和雙鍵，同時根據離子m/z 55、74、97、123、180、222、264、296可以確定其為油酸甲酯。

圖2 豆醬中油酸甲酯質譜圖Fig.2 Mass spectrums of 9-octadecenoic acid methyl esters from soybean paste

2.1.3 雙不飽和脂肪酸甲酯質譜特征

雙不飽和脂肪酸甲酯的分子離子中羰基發生α斷裂，產生[M-31]+，雙鍵遷移進行α斷裂產生C5H7+離子m/z 67，由此可得到雙不飽和脂肪酸的特征離子為m/z 67、[M-31]+和分子離子[13]。雙鍵位置不同的異構體，質譜圖相同，這是因為雙鍵有相似的活動性，見圖3。

圖3 豆醬中亞油酸甲酯質譜圖Fig.3 Mass spectrum of 9,12-octadecadienoic acid methyl esters from soybean paste

由圖3可知，脂肪酸甲酯的分子離子質荷比為294，據此可確定脂肪酸的碳原子數目為18，分子離子中羰基發生α斷裂產生離子[M-31]+離子m/z 263，基峰離子為67，可確定其含有2 個不飽和雙鍵，同時根據離子m/z 55、67、95、123、263和294可確定其為亞油酸甲酯。

2.1.4 多不飽和脂肪酸甲酯質譜特征

多不飽和脂肪酸甲酯的分子離子中羰基發生α斷裂產生[M-31]+離子，雙鍵遷移發生α斷裂產生環狀C6H7+離子m/z 79[16]，此離子為多不飽和脂肪酸的基峰離子，形成此基峰離子的條件為脂肪鏈中至少有3個且間隔不得大于一個亞甲基的雙鍵[16]，因此可得到多不飽和脂肪酸的特征離子為m/z 79、[M-31]+和分子離子M+[17]。雙鍵位置不同的異構體，質譜圖相同，這是因為雙鍵有相似的活動性，見圖4。

圖4 豆醬中亞麻酸甲酯質譜圖Fig.4 Mass spectrum of 9,12,15-octadecatrienoicacid methyl esters from soybean paste

由圖4可知，脂肪酸的分子離子質荷比為m/z 292，據此可確定脂肪酸的碳原子數目為18，分子離子中的羰基發生α斷裂產生離子[M-31]+離子m/z 261，基峰離子為79，可確定其含有3 個不飽和雙鍵，同時根據離子m/z 55、67、79、95、108、121、236、261和292可確定其為亞麻酸甲酯。

2.2 豆醬中脂肪酸酸酯化成分分析

采用酸酯化法對豆醬中的脂肪酸進行甲酯化，在設定條件下進樣分析，見圖5。

圖5 脂肪酸酸酯化法的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of fatty acids estered by acid from soybean paste

采用人工解析及NIST11.L譜庫檢索定性的方法對各色譜峰相應的質譜圖進行解析，采用面積歸一化法計算各成分的相對含量，結果見表1。

表1 豆醬中脂肪酸酸酯化法的組成及含量Table 1 Composition and contents of fat acids estered by acid in soybean paassttee

由表1可知，采用酸酯化法對豆醬中脂肪酸進行甲酯化，共檢測到10 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸有7 種，分別為9-甲基十四烷酸甲酯、十五酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、棕櫚酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯、十七酸甲酯和花生酸甲酯；不飽和脂肪酸有3 種，分別為油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯。傳統豆醬中含有人體所必需的亞油酸和亞麻酸，并且含量較高，占所鑒定出的脂肪酸總量的69.91%。值得注意的是，傳統豆醬中含有9-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十六酸甲酯、十五酸甲酯和十七酸甲酯等支鏈脂肪酸和奇數碳原子脂肪酸。有研究報道稱，奇數碳原子脂肪酸有很高的抗癌活性[18-23]，這也說明食用自然發酵的豆醬有益于人體健康。

2.3 豆醬中脂肪酸堿酯化成分分析

采用堿酯化法對豆醬中的脂肪酸進行甲酯化，在設定條件下進樣分析，見圖6。

圖6 脂肪酸堿酯化法的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatorgram of fatty acids estered by alkaline from soybean paste

由于脂肪酸及油脂的沸點高，高溫條件下易裂解從而造成損失，因此需要進行甲酯化。堿酯化的目的是通過酯交換反應得到脂肪酸甲酯，但在反應過程中，油脂易與氫氧化鉀發生皂化反應得到脂肪酸鹽，脂肪酸鹽能溶于有機溶劑，在GC-MS分析過程中，由于脂肪酸鹽的影響造成脂肪酸總離子流圖的基線漂移，因此分析豆醬中的脂肪酸不宜采用堿酯化方法。

采用人工解析及NIST11.L譜庫檢索定性的方法對各色譜峰相應的質譜圖進行解析，采用面積歸一化法計算各成分的相對含量，結果見表2。

表2 豆醬中脂肪酸堿酯化法的組成及含量Table 2 Composition and contents of fat acids estered by alkali in soybean paassttee

由表2可知，采用堿酯化法對豆醬中的脂肪酸進行甲酯化，共檢測到4 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸有1 種，為棕櫚酸甲酯；不飽和脂肪酸有3 種，分別為油酸甲酯、亞

油酸甲酯和亞麻酸甲酯。通過與表1比較可知，堿酯化法分析出4 種脂肪酸，而酸酯化法分析出10 種脂肪酸，并且這4 種脂肪酸的數值明顯低于酸酯化方法分析出的數值；萃取過程中，堿酯化方法得到的溶液渾濁，不易分層；在同樣的質譜條件下，堿酯化法得到的總離子流圖基線明顯漂移而酸酯化法無此種情況，因此堿酯化法不適合分析豆醬中的脂肪酸。

2.4 豆醬中脂肪酸酸堿酯化成分分析

采用酸堿酯化法對豆醬中的脂肪酸進行甲酯化，在設定條件下進樣分析，見圖7。

圖7 脂肪酸酸堿酯化法的總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of fatty acids estered by acid and alkali from soybean paste

采用人工解析及NIST11.L譜庫檢索定性的方法對各色譜峰相應的質譜圖進行解析，采用面積歸一化法計算各成分的相對含量，結果見表3。

表3 豆醬中脂肪酸酸堿酯化法的組成及含量Table 3 Composition and contents of fat acids estered by acid and alkali in soybean paste

由表3可知，采用酸堿酯化法對豆醬中脂肪酸進行甲酯化，共檢測到10 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸有7 種，分別為9-甲基十四烷酸甲酯、十五酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、棕櫚酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯、十七酸甲酯和花生酸甲酯；不飽和脂肪酸有3 種，分別為油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯。

通過比較表1和表2可知，酸堿酯化法和酸酯化法分別得到10 種脂肪酸而堿酯化法得到4 種脂肪酸，數量上除亞麻酸甲酯的酸堿酯化法得到的數值略低于酸酯化法，其余脂肪酸甲酯的分析數值均大于或等于酸酯化法和堿酯化法；實驗操作過程中酸堿酯化法處理后的溶液較酸酯化法處理的溶液更易分層，分離時間短并且效果較好，堿酯化處理的溶液不易分層，靜置30 min仍達不到良好的分層效果；在相同的色譜條件下酸堿酯化法和酸酯化法得到的總離子流圖基線穩定，分析狀態良好，而堿酯化法得到的總離子流圖在24 min后發生基線漂移影響分析結果。因此通過綜合比較不同甲酯化方法的分析結果可知酸堿酯化法更適合分析豆醬中的脂肪酸。

3 結 論

采用GC-MS法檢測，依據標準譜庫NIST11.L同時結合有機質譜學規律對豆醬中脂肪酸甲酯進行定性分析。通過基峰可確定脂肪酸的不飽和度：基峰m/z 74為飽和脂肪酸，基峰m/z 55為含1 個雙鍵的不飽和脂肪酸，基峰m/z 67為含2 個雙鍵的不飽和脂肪酸，基峰m/z 79為含3 個雙鍵的不飽和脂肪酸，再通過[M-43]+、[M-32]+、[M-31]+和重排離子進一步確認脂肪酸的種類[24]。本實驗采用的定性方法不僅定性準確，同時節省昂貴的脂肪酸標準品在不同的色譜條件下重復使用。

本實驗采用酸酯化法、堿酯化法和酸堿酯化法對豆醬中的脂肪酸進行甲酯化，經GC-MS分析，通過比較豆醬油脂在同一色譜條件下的質譜圖可以得出：甲酯化方法直接影響脂肪酸的分離效果。酸酯化法和酸堿酯化法分別得到10 種脂肪酸，而堿酯化法得到4 種脂肪酸。酸堿酯化法甲酯化效率高，分析出的脂肪酸數值高于酸酯化法，這說明酸堿酯化法能夠對多種脂肪酸進行甲酯化并且甲酯化效率高，這與柴沙駝等[25]采用不同甲酯化方法分析犢牦牛肉中的脂肪酸得到的結果一致，與張述瓊等[26]采用不同甲酯化方法分析亞麻種子油的結果一致。酸酯化法適用面廣，可分析游離脂肪酸和結合態脂肪酸，但甲酯化程度低[10,27]；堿酯化法只適合分析結合態脂肪，但反應條件溫和，避免了多不飽和脂肪酸的氧化和異構化[28]。酸堿酯化法結合了酸酯化法和堿酯化法的優點，分析效果最好，因此本實驗采用酸堿酯化法分析豆醬中的脂肪酸。

傳統豆醬中含有10 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸有7 種，分別為9-甲基十四烷酸甲酯、十五酸甲酯、14-甲基十 五烷酸甲酯、棕櫚酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯、十七酸甲酯和花生酸甲酯。不飽和脂肪有3 種，分別為油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯，其中必需脂肪酸亞油酸和亞麻酸含量占脂肪酸總量的59.76%。另外，傳統豆醬中還含有9-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十六酸甲酯、十五酸甲酯和十七酸甲酯等支鏈脂肪酸和奇數碳原子脂肪酸，有研究報道，支鏈脂肪酸和奇數碳原子脂肪酸都具有一定的功能性，因此食用傳統豆醬有益于人體健康。

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Selection of Optimal Fatty Acid Esterification Method for Analysis of Fatty Acid Composition of Traditional Soybean Paste

TIAN Tian, WU Jun-rui, YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Chin a)

The fatty acids of traditional soybean paste were extracted by Soxhlet extraction and esterified with acid and/or alkaline, and then the esterified products were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) after extraction with n-hexane, identified by spectral searching using the NIST11.L mass spectral library combined with organic mass spectral data and quantified by peak area normalization. Results showed that complete separation of the fatty acid methyl esters was achieved in 33 minutes after derivatization. Ten kinds of fatty acids were identified by acid esterification, among which the predominant fatty acids were n-hexadecanoic acid methyl ester (13.62%), oleic acid methyl ester (23.95%) and linoleic acid methyl ester (48.91%). Four kinds of fatty acids were identified by alkaline esterification, among which the predominant fatty acids were oleic acid methyl ester (10.42%) and linoleic acid methyl ester (19.63%). Ten kinds of fatty acids were identified by acid-alkaline esterification, among which the predominant fatty acids were n-hexadecanoic acid methyl ester (13.64%), oleic acid methyl ester (24.16%) and linoleic acid methyl ester (49.07%). To conclude, the acidalkaline esterification method allows rapid, accurate and reliable identification of fatty acids in traditional soybean paste without using

tandards.

traditional soybean paste; fatty acid; methylation; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS264.2

A

1002-6630（2014）18-0078-06

10.7506/spkx1002-6630-201418015

2013-11-28

國家自然科學基金重點項目（31000805）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100902）；遼寧省教育廳科學技術研究項目（L2012249）

田甜（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：13898164546@163.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：yxqsyau@126.com