板藍根抗氧化成分的提取及活性分析

趙琳靜，李洪森，吳曉英，喬 妍，王 磊，林旭東，燕方龍

（上海工程技術大學化學化工學院，上海201620）

板藍根抗氧化成分的提取及活性分析

趙琳靜，李洪森，吳曉英，喬 妍，王 磊，林旭東，燕方龍*

（上海工程技術大學化學化工學院，上海201620）

采用95%乙醇提取板藍根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后藥渣通過水提醇沉法制備粗多糖。采用鐵氰化鉀還原反應、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三種抗氧化模型，比較上述極性部位的抗氧化活性，并考察抗氧化活性與總糖含量的關系。結果表明，板藍根不同極性部位的抗氧化活性差異較大，與總糖含量相關性較小。其中，氯仿萃取物對超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率最高，IC50值分別為3.38、0.19mg/mL，是從板藍根中篩選非多糖類天然抗氧化劑的重要部位。醇提后藥渣通過水提醇沉法制得的粗多糖部位總糖含量最高，為18.66%。板藍根所具有的抗氧化活性可能是該藥發揮解“內毒”作用的重要機制。

板藍根，抗氧化，多糖，還原能力，超氧陰離子自由基，DPPH自由基

板藍根（Indigowoad Root）為我國清熱解毒類代表藥物，別名藍靛根、靛青根等，是十字花科植物菘藍（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗內毒素、抗炎、抗腫瘤及免疫調節等藥理活性[1]。自由基是生物體氧化反應產生的“內生毒素”，與機體許多功能障礙和疾病發生，如吞噬、中毒、炎癥、腫瘤、衰老、輻射損傷等有密切關系，由自由基所引起的疾病已多達100余種[2]。從減少自由基的堆積、抑制過氧化反應角度研究清熱解毒類中藥的作用機制具有重要意義[3]。

多糖廣泛存在于自然界，是許多植物中草藥有效成分之一，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質過氧化等作用[4]。現代藥理研究證實，板藍根多糖在體外、體內也均顯示出較好的抗氧化作用[5-6]。但是，迄今為止，尚未見有關系統考察板藍根不同極性部位中多糖含量與抗氧化性能關系的報道。本研究采用95%乙醇提取板藍根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后藥渣通過水提醇沉法制備粗多糖。采用苯酚-硫酸法及鐵氰化鉀還原反應、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三種抗氧化模型，測定板藍根不同極性部位的多糖含量，研究其體外抗氧化活性，并對抗氧化活性與多糖含量的關系進行分析，為后期進一步開展板藍根抗氧化活性成分的篩選及機制研究提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板藍根飲片 購自上海余天成醫藥有限公司，40℃干燥，粉碎，過20目篩；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·） 購自Sigma-Fluka公司；無水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、葡萄糖、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

UV-7504紫外可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海逸龍科技有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 板藍根醇提物、各分級萃取物及總糖部位的制備[7]稱取板藍根粉末150g，加入750mL 95%乙醇水浴提取兩次，每次3h。過濾，合并濾液，減壓濃縮，40℃真空干燥，得板藍根乙醇提取物（EE），稱重并計算提取率。將所得EE分散于水中，采用系統溶劑萃取法分級萃取，依次得石油醚部位（PEF）、氯仿部位（CF）、正丁醇部位（BF）及剩余水層（WR）。將各部位旋轉濃縮，真空干燥，稱重并計算提取率。

稱取干燥后板藍根濾渣，加40倍體積水于80℃水浴提取1.5h，過濾，濾液旋轉濃縮后加無水乙醇使含醇量達75%，4℃靜置過夜。過濾，沉淀物40℃真空干燥，得板藍根粗多糖（CPS），稱重并計算提取率。

1.2.2 總糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[8]測定不同極性部位總糖含量。以無水葡萄糖為標準品。

總糖含量（%）=總糖質量/提取物質量×100

1.2.3 還原能力的測定 采用鐵氰化鉀還原法[7]進行。2.5mL磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）中加入2.5mL供試品溶液及2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，振蕩混勻后于50℃水浴反應20min。急速冷卻，加2.5mL 10%三氯乙酸，3000r/min離心10min。取上層清液5mL，加入5mL水和1mL 0.1%FeCl3，混勻，室溫靜置10min后于700nm測吸光度（A）。每個樣本平行處理三次。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定 通過鄰苯三酚自氧化反應產生O2-·，參照文獻方法[9-10]并略加修改。精密移取50mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH8.20）6mL于具塞試管中，加入供試液1mL，于37℃水浴保溫10min，然后加入37℃預熱的7mmol/L鄰苯三酚1.0mL，混勻，準確反應4min后，迅速用0.5mL濃鹽酸終止反應，于320nm測定吸光度（A）。以BHT和維生素C為陽性對照。每個樣本平行處理三次。按照以下公式，計算板藍根不同極性部位對體系中O2-·的清除能力。

清除率（%）=[（A空－A測）/A空]×100

式中，A空為鄰苯三酚自氧化反應速率，A測為加入各極性部位后鄰苯三酚自氧化反應速率。

如果O2-·清除率與樣品濃度的量效關系呈線性，則求出回歸方程和相關系數R2，計算清除率達50%時所需的樣品量IC50。

1.2.5 清除DPPH自由基（DPPH·）能力的測定 參照文獻[11]進行。精密移取不同濃度的各供試品溶液2mL于具塞試管中，加入0.1mmol·L-1的DPPH·溶液2mL，振蕩后室溫反應30min，于517nm測定吸光度（A）。以BHT和維生素C為陽性對照。每個樣本平行處理三次。按照以下公式，計算板藍根不同極性部位對DPPH·的清除能力。

清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100

式中，A1為2mL DPPH·溶液與2mL樣品液混合后測得的吸光度；A2為2mL樣品液與2mL無水乙醇混合后測得的吸光度；A0為2mL DPPH·溶液與2mL無水乙醇混合后測得的吸光度。

如果DPPH·清除率與樣品濃度的量效關系呈線性，則求出回歸方程和相關系數R2，計算清除率達50%時所需的樣品量IC50。

1.2.6 數據處理 數據采用SPSS 16.0軟件進行雙變量相關性分析，以p＜0.05為差異顯著。文中所有數據均以平均數±標準差（mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

按1.2.2項下方法，以吸光度A為縱坐標、濃度C（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y= 0.054X+0.017，R2=0.098。結果表明，無水葡萄糖在5～40μg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 板藍根不同極性部位的提取率和總糖含量

板藍根乙醇總提物EE經液-液萃取得到的4個萃取部位的提取率順序為WR＞BF＞PEF＞CF，醇提后藥渣經水提醇沉法得到的CPS提取率為13.42%。根據回歸方程計算各部位中總多糖含量（表1）。結果表明，板藍根乙醇提取物EE中總糖含量遠遠低于藥渣經水提醇沉獲得的CPS中總糖含量。醇提物四個分級萃取產物（PEF、CF、BF和WR）的總糖含量隨提取溶劑極性增加而增大，與多糖極性大、難溶于脂溶性有機溶劑有關。

表1 板藍根不同極性部位的提取率和總糖含量Table 1 Yields and total sugar contents of different polar fraction from Indigowoad Root

2.3 板藍根不同極性部位的還原能力測定

還原能力反映了物質的供電子能力，是評價物質體外抗氧化活性常用的指標，可間接反映抗氧化活性的強弱。鐵氰化鉀還原法的原理是，具有還原能力的物質可使鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀在酸性條件下與Fe3+絡合形成普魯士藍，在700nm處有最大吸收。因此，吸光度越大，表示樣品的還原能力越強。

K3Fe（CN）6+樣品→K4Fe（CN）6+樣品氧化物

K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

由圖1可知，各供試液濃度與還原能力呈正相關，隨著樣品濃度增大，還原能力不斷增強。相同濃度時，CF的還原能力明顯高于CPS及其他極性部位，還原能力順序為：CF＞CPS＞EE＞WR＞PEF＞BF。

圖1 板藍根不同極性部位的還原能力（n=3）Fig.1 Reducing power of different polar fraction from Indigowoad Root（n=3）

2.4 板藍根不同極性部位對O2-·的清除能力

O2-·為體內壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈式反應的引發劑，生成活性更強的·OH，造成機體進一步氧化損傷。鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化反應，釋放O2-·，并形成一系列有色中間產物。抗氧化劑的加入可抑制該氧化過程，減少有色物生成，使吸光度減小。由圖2可知，板藍根不同極性部位對O2-·的清除能力明顯低于陽性對照BHT和維生素C。相同濃度時，CF對O2-·的清除能力明顯高于CPS及其他極性萃取部位，計算得IC50為3.38mg/mL。各極性部位清除率大小順序為CF＞CPS＞BF＞EE＞WR＞PEF。

圖2 板藍根不同極性部位對超氧陰離子自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.2 Scavenging superoxide free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.5 板藍根不同極性部位對DPPH·的清除能力

DPPH法是清除自由基能力測定的常用方法之一，廣泛應用于各種天然提取物體外抗氧化活性的評價。DPPH·是一種穩定的、在醇溶液呈紫色的自由基，在517nm處有強吸收。抗氧化劑可使其在該波長處吸收減弱，且吸光度減小程度與自由基被清除程度呈線性關系。由圖3可知，在測定濃度范圍內，板藍根6個極性萃取部位對DPPH·的清除能力明顯高于對O2-·的清除能力，清除率大小順序為CF＞BF＞EE＞CPS＞PEF＞WR。其中，CF和BF的清除能力高于其他部位，當濃度達到1.25mg/mL時，CF和BF的清除能力分別為89.34%和85.91%，接近陽性對照BHT和維生素C；IC50分別為0.19、0.62mg/mL。

圖3 板藍根不同極性部位對DPPH自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.3 Scavenging DPPH free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.6 相關性分析

板藍根不同極性部位在三個抗氧化模型上表現出的活性與總糖含量進行了相關性分析，相關系數分別為：還原能力，r=0.004；O2-·清除率，r=0.248；DPPH·清除率，r=-0.444，且均無顯著性差異。可見，板藍根不同極性部位的抗氧化性與總糖含量相關性較小。

3 結論

板藍根不同極性部位的抗氧化活性有較大差異，與總糖含量相關性較小。氯仿萃取部位表現出優于粗多糖及其他極性部位的還原能力和清除超氧陰離子自由基及DPPH自由基的能力，值得引起對板藍根脂溶性抗氧化活性成分的進一步研究的關注。目前，板藍根抗氧化活性成分的研究多集中在多糖部位，本實驗所采用的系統比較研究策略為從板藍根中篩選作用更強的天然抗氧化劑，并進一步探討其作用機制提供了實驗基礎。

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Extraction of antioxidant components from Indigowoad Root and evaluation their antioxidation in vitro

ZHAO Lin-jing，LI Hong-sen，WU Xiao-ying，QIAO Yan，WANG Lei，LIN Xu-dong，YAN Fang-long*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai University of Engineering Science，Shanghai 201620，China）

Indigowoad Root was extracted with 95%ethanol，and then the extract was partitioned with petroleum ether，chloroform and n-butanol successively.The crude polysaccharides was obtained from water extract and ethanol precipitate.The antioxidation of different end extracts were studied by potassium ferricyanide reduction assay，superoxide anion free radical scavenging assay and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1（DPPH）radical scavenging assay.The relationship between the antioxidant activity and the content of total sugar was analysed.The results showed that the antioxidant activities had great difference in six polar extracts from Indigowoad Root，and the content of total sugar had low correlation with the activities.The chloroform extract showed that the highest radical scavenging rate on superoxide anion free radical and DPPH free radical，and the IC50were 3.38mg/mL and 0.19mg/mL，respectively.The chloroform extract was identified as an important fraction for further screening antioxidant components except polysaccharides.The highest content of total sugar came from crude polysaccharides extract and the content was 18.66%.The antioxidation could be one of the mechanisms in detoxication of Indigowoad Root.

Indigowoad Root；antioxidation；polysaccharides；reducing power；superoxide anion free radical；DPPH free radical

TS255.1

A

1002-0306（2014）10-0195-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.035

2013－10－09 *通訊聯系人

趙琳靜（1979-），女，博士在讀，講師，研究方向：天然產物提取與活性研究。

上海高校教師培養計劃項目（B8938-11-0545）；上海市大學生創新訓練項目（cs1204006）。