分離自傳統腌制魚類的乳酸菌株發酵特性研究

游 剛，吳燕燕，李來好，楊賢慶，陳勝軍

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300）

分離自傳統腌制魚類的乳酸菌株發酵特性研究

游 剛1，2，吳燕燕2，*，李來好2，楊賢慶2，陳勝軍2

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300）

為篩選出適宜于腌制魚類加工需要的優良乳酸菌，從傳統腌制魚中分離到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，Pp）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，Lb）5種乳酸菌株的發酵特性。主要對其進行生化、耐鹽性、鹽濃度下的產酸能力和不同溫度下的生長曲線、拮抗性能等進行實驗。結果表明：5種乳酸菌株具有產酸不產氣，不產粘液、H2O2、氨、H2S的特性；在鹽濃度8%～12%能生長；在8%鹽濃度下，24h內產酸基本穩定；生長曲線相似且最適生長溫度都在30℃左右。菌種之間的拮抗性實驗表明，La與Lm、La與Lp、Pp與Lm之間有較弱的拮抗作用，能滿足混合發酵要求。該研究為下一步建立快速低鹽魚類腌制加工新技術提供理論依據。

腌制魚類，乳酸菌，發酵特性

咸魚等傳統魚類腌制品多屬自然發酵，具有特有的腌香風味而備受消費者喜愛。但是傳統腌制生產時間長，并且自然發酵條件不易控制，產品的質量難于控制。利用現代生物技術改進傳統魚類腌制品加工技術是當前水產品加工亟需解決的問題。

近些年來國內外對傳統發酵食品進行菌相分析和嗜鹽優勢菌種的篩選研究表明乳酸菌類是腌制食品加工中的優勢菌。盧曉莉[1]從自然發酵的魚鲊制品中分離篩選出5株性能優良、產酸不產氣、不產粘液的同型發酵乳酸菌株。田國軍、WOOD BJB等[2-3]從傳統臘魚中分離純化得到優勢微生物主要為乳酸菌，并且發現乳酸菌能夠改善腌制品質量和風味，縮短腌制時間。Paludan-Müller等[4]研究了在不同濃度的食鹽下一種泰國發酵魚plaa-som的發酵過程和菌相變化，在發酵過程中分離出優勢微生物主要為乳酸菌。因此，在咸魚等傳統魚類腌制加工時，發酵過程中，乳酸菌起了至關重要的作用，它們對腌制魚類特征風味的產生發揮重要的作用[5]。

不同種類的乳酸菌對腌制魚產品質量會產生不同的影響，因為有的乳酸菌由于缺乏生長競爭性，會產生H2O2、H2S等影響產品風味。本文在前期研究基礎上[1-6]，主要對從腌制魚中分離得到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus，Pp）、腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，Lm）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，Lb）5種乳酸菌株的生化特性和發酵性能進行了研究，從中篩選出適合用于腌制咸魚加工的乳酸菌發酵劑，為下一步改進傳統魚類腌制技術，建立快速低鹽魚類腌制加工新技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，Pp） 分離自臺山市廣海鎮李貴記水產品加工廠腌制大黃魚（Pseudosciaena crocea）；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，Lb） 分離自臺山市廣海鎮李貴記水產品加工廠腌制三牙魚（Otolithes ruber）；液體MRS培養基，PCA培養基，MRS瓊脂培養基等培養基 均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

SHP-150型生化培養箱 上海精宏設備有限公司；GENESYSTM5型風光光度計 日本Spectronic公司；SA-900-1JZ型超凈工作臺 上海稼豐園藝用品公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；Sigma-3K30型高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的活化 分別將保藏的菌株轉接到已滅菌的MRS培養基中，（30±2）℃培養24h，移出2mL菌液接種到已滅菌的新MRS液體培養基中，在相同條件下重復培養，連續進行3次活化，得到活化的乳酸菌培養液[7]。

1.2.2 5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）的生化特性實驗 葡萄糖產酸、產氣、產粘液實驗，產氨實驗，產生H2S、H2O2實驗，參考文獻[7-8]。

1.2.3 5種乳酸菌株的耐鹽性實驗 參考Leroy F和Shen M M[9-10]的方法略作改進，在MRS液體培養基中分別添加0%、4%、8%、12%、16%的NaCl，按2%的接種量接種已活化菌液，（30±2）℃培養24h。取一定量的菌液，若菌液濃度過大，需進行同比例稀釋，減小OD值測量誤差，然后測定接種的MRS液體培養基在600nm處的吸光值（OD），同時做不接種空白對照。

1.2.4 5種乳酸菌株的產酸實驗[9-10]按2%接種量將活化后的菌液接種到MRS液體改良培養基（添加8% NaCl）中，（30±2）℃培養，每隔12h用pH計測定培養基的pH。

1.2.5 5種乳酸菌株在不同溫度下的生長情況[9-10]乳酸菌生長曲線的測定采用比濁法。按2%接種量將活化后的菌液接種到MRS液體改良培養基（添加8% NaCl）中，分別在20、25、30、35、40、45℃培養18h。取一定量的菌懸液，若菌液濃度過大，需進行同比例稀釋，減小OD值測量誤差，然后測定在600nm處的吸光值（OD），同時做不接種空白對照。

1.2.6 5種乳酸菌株間的拮抗實驗[11-12]在一定條件下，將不同菌懸液稀釋至同一稀釋度（109cfu/mL），用接種環挑取適量的菌，垂直法劃線接種于MRS平板上，于（30±2）℃恒溫箱中培養48h后，觀察兩垂直線交界處菌的生長情況。如無菌生長，則說明這兩菌株之間有拮抗性。否則，無拮抗性。

1.2.7 拮抗程度檢驗 將有拮抗反應的活化菌液（稀釋至同一稀釋度109cfu/mL）分別取4mL接種到50mL MRS液體改良培養基（添加8%NaCl）中，然后按1∶1的比例混合（每種菌2mL）分別接種到50mL相同的MRS改良肉湯培養基中，在（30±2）℃培養48h，采用平板計數法計數。

1.2.8 數據處理 采用SPSS 19.0軟件處理及分析各實驗數據。

2 結果與分析

2.1 5種乳酸菌株的發酵特性分析

乳酸菌篩選標準[6]：在咸魚等魚類腌制品的生產中，乳酸菌發酵劑應具有發酵葡萄糖不產氣，不產H2O2、氨、H2S、能共存等特點。5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）的發酵特性結果見表1。5種乳酸菌株具有產酸不產氣，不產粘液、H2O2、氨、H2S的特性。說明其可用于魚類制品的發酵。

表1 5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）的發酵特性Table 1 The fermentation properties of 5 strains（Lp，Pp，Lm，La，Lb）

2.2 5種乳酸菌株的耐鹽性實驗

5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）在不同鹽濃度（W/V）下（0%、4%、8%、12%、16%）的生長情況見圖1。由圖1可知，食鹽濃度對5種乳酸菌的生長均有影響。當含鹽量在0%～4%時，5種乳酸菌株的吸光值變化不大；當含鹽量增至8%時，5種乳酸菌株的吸光值出現不同程度的下降，Lb的OD值由2.378變為0.91，減少了1.468，Lp的OD值由2.319變為0.915，Pp的OD值由2.308降到1.107，La的OD值由1.644降為0.95，Lm的OD值由1.065降到0.821。總體來說，Lm的耐鹽性較好。當含鹽量增加到12%時，5種乳酸菌株的OD值顯著降低（p＜0.05），但5種乳酸菌株仍可生長。當食鹽的濃度繼續加大，5種乳酸菌株的吸光度都呈現了急劇下降的趨勢，當食鹽濃度達到16%的時候，所有的菌種的吸光度都接近0，說明了菌株的生長都受到了抑制，菌種的生長都基本停止了。實驗結果表明，5種乳酸菌株的生長趨勢與Rathore S等[13]研究結果相似，5種乳酸菌株均能耐受8%～12%的鹽度。

圖1 5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）在不同鹽度下的生長情況Fig.1 The growth situation of 5 strains（Lp，Pp，Lm，La，Lb）in different concentrations of NaCl（W/V）

2.3 5種乳酸菌株的產酸實驗

產酸能力是作為篩選發酵劑菌種的一個重要指標[14]。5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）在含8%NaCl的培養液中生長80h的pH變化見圖2。Lp、Pp和La 3種乳酸菌株在0～8h內pH迅速下降，在8～24h pH緩慢下降，產酸曲線表現出基本相似的趨勢，24h后3種菌株產酸基本穩定。Lp、Pp產酸速率較La大，前兩者產酸曲線基本重合；在0～24h，3種乳酸菌株懸液的pH由5.8分別降到3.64，3.71和4.02，變化顯著（p＜0.05），之后保持在穩定值，可能是由于培養液pH下降，影響了菌株的生長。Lb菌株的pH則隨著培養時間的延長而緩慢下降，維持一個穩定的產酸能力，說明Lb菌株對酸性環境的耐受性較強。Lm菌株在0～8h內略有下降，在8～40h內，菌液pH變化趨于平穩，可能是由于食鹽減緩了菌株的生長，然而在48～72h時，Lm菌液pH出現極顯著下降（p＜0.01），可能是由于菌株生長環境改變，72h后菌液pH趨于穩定，可能是由于生長環境過酸，影響Lm菌株的生長。該實驗結果與Katina K等[15]研究結果吻合。結果表明，在含8%NaCl的培養液中，5種乳酸菌株在24h內產酸基本穩定，可用于魚類腌制加工，實現魚肉的快速發酵目的。

圖2 5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）在80h內pH的變化Fig.2 The pH value changes of 5 strains（Lp，Pp，Lm，La，Lb）within the 80h

2.4 5種乳酸菌株在不同溫度下的生長情況

由圖3可知，不同溫度下5種乳酸菌株的生長情況不同，溫度過高或過低均影響乳酸菌株生長速率，Lp和Pp對溫度的耐受性較高，其次是La和Lb菌株，對溫度變化最敏感的是Lm菌株，不同菌株的整體生長對溫度的變化趨勢與Zhang等[16-17]研究結果吻合。實驗結果表明，在含有8%NaCl的培養液中，5種乳酸菌株最適生長溫度均約為30℃，此時五種菌液的OD值變化顯著（p＜0.05）。

圖3 5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）在不同溫度下的生長情況Fig.3 The growth situation of 5 strains（Lp，Pp，Lm，La，Lb）in different temperature

2.5 5種乳酸菌株間的拮抗實驗

由于多數乳酸菌都能產生具有抗菌作用的細菌素，復合菌種之間可能產生相互抑制作用，在復配發酵劑時有必要對菌種之間的拮抗性進行驗證，以便于篩選出發酵效果最佳的復配發酵劑。但多數抗菌素譜較窄，只能對少數菌起到抑制作用。5種乳酸菌株之間的拮抗作用結果見表2。實驗結果表明，La與Lm、La與Lp、Pp與Lm之間有拮抗作用。實驗結果與劉法佳等[6]，劉安軍等[18]研究結果吻合。

表2 5種菌（Lp、Pp、Lm、La、Lb）之間的拮抗作用結果Table 2 The antagonism results among 5 strains（Lp，Pp，Lm，La，Lb）

2.6 乳酸菌株間的拮抗程度檢驗

混合菌株培養后，采用平板計數法對菌落總數進行計數，如果菌株菌落總數增加，則表明菌株之間拮抗作用不強烈，仍可以生長，可以混合一起用作發酵劑。La與Lm、La與Lp、Pp與Lm拮抗程度檢驗結果見表3。由表3可知，培養12h時，單獨培養的菌株菌落總數要多于混合培養菌株的菌落總數，可見有拮抗作用，24h后，混合培養的菌株菌落總數少于單獨培養的菌株，但均能達到109數量級，保持比較高的水平，此時菌液的pH下降到4.65，滿足發酵要求[19-21]。所以，La與Lm、La與Lp、Pp與Lm均可混和培養作為復合發酵劑。

表3 La與Lm、La與Lp、Pp與Lm拮抗程度檢驗結果Table 3 The degree of antagonism between La and Lm，La and Lp，Pp and Lm

3 結論

5種乳酸菌株（Lp、Pp、Lm、La、Lb）生化特性鑒定實驗表明均可用于咸魚等魚類腌制加工，能耐受8% ～12%的食鹽濃度，最適生長溫度在30℃左右，在24h內產酸基本穩定。菌種之間的拮抗性實驗表明，La與Lm、La與Lp、Pp與Lm之間有拮抗作用，但拮抗作用較弱，仍然能滿足混合發酵要求。所以5種乳酸菌株按一定比例復配，可以用于腌制魚類的快速腌制發酵。

[1]盧曉莉，曾令彬，熊善柏.鲊魚制品固態發酵工藝條件的優化[J].食品工業科技，2007，28（8）：157-160.

[2]田國軍，尚艷艷，黃澤元.臘魚中優勢乳酸菌的分離、純化及性質鑒定[J].食品與發酵工業，2011，37（6）：78-81.

[3]WOOD BJB.Microbiology of fermented foods[M].New York and London：Elsevier Applied Science，1985：270-290.

[4]Paludan-Müller C，Madsen M，Sophanodora P，et al. Fermentation and microflora of plaa-som，a Thai fermented fish product prepared with different salt concentrations[J].International Journal of Food Microbiology，2002，73（1）：61-70.

[5]丁麗麗，吳燕燕，李來好，等.咸帶魚加工過程揮發性風味成分的變化[J].食品科學，2011，32（24）：208-212.

[6]劉法佳，吳燕燕，李來好，等.降解咸魚中亞硝酸鹽的乳酸菌降解特性研究[J].廣東農業科學，2012，39（1）：94-97.

[7]劉慧.現代食品微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工業出版社，2006：262-265.

[8]田國軍.臘魚中優勢乳酸菌的分離，鑒定及直投式生產工藝研究[D].武漢：武漢工業學院，2011.

[9]Leroy F，De Vuyst L.Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry[J].Trends in Food Science&Technology，2004，15（2）：67-78.

[10]Chen M M，Liu Q H，Xin G R，et al.Characteristics of lactic acid bacteria isolates and their inoculating effects on the silage fermentation at high temperature[J].Letters in Applied Microbiology，2013，56（1）：71-78.

[11]Papamanoli E，Kotzekidou P，Tzanetakis N，et al. Characterization of Micrococcaceae isolated from dry fermented sausage[J].Food Microbiology，2002，19（5）：441-449.

[12]Visser R，Holzapfel W H，Bezuidenhout J J，et al.Antagonism of lactic acid bacteria against phytopathogenic bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology，1986，52（3）：552-555.

[13]Rathore S，Salmerón I，Pandiella S S.Production of potentially probiotic beverages using single and mixed cereal substrates fermented with lactic acid bacteria cultures[J].Food Microbiology，2012，30（1）：239-244.

[14]Wang Q，Yamabe K，Narita J，et al.Suppression of growth of putrefactive and food poisoning bacteria by lactic acid fermentation of kitchen waste[J].Process Biochemistry，2001，37（4）：351-357.

[15]Katina K，Poutanen K.Nutritional Aspects of Cereal Fermentation with Lactic Acid Bacteria and Yeast[M].Springer US，2013：229-244.

[16]Zhang D L，McQuestin O J，Mellefont L A，et al.The influence of non-lethal temperature on the rate of inactivation of vegetative bacteria in inimical environments may be independent of bacterial species[J].Food Microbiology，2010，27（4）：453-459.

[17]劉素純，胡茂豐，李宗軍.自然發酵肉制品中乳酸菌的分離及特性研究[J].食品與機械，2006，22（2）：62-65.

[18]劉安軍，何立蓉，鄭捷，等.發酵帶魚乳酸菌種的篩選及其工藝優化[J].現代食品科技，2010，26（9）：948-951.

[19]傅力，葛鈺瑛，李煥榮，等.發酵羊肉乳酸菌發酵劑的篩選及發酵性能研究[J].新疆農業科學，2009，46（3）：630-634.

[20]劉素純，胡茂豐，李宗軍.自然發酵肉制品中乳酸菌的分離及特性研究[J].食品與機械，2006，22（2）：62-65.

[21]于立梅，劉學軍，白衛東，等.發酵里脊火腿菌種篩選及發酵特性研究[J].現代食品科技，2008，24（9）：865-869.

Study on fermentation properties of five bacterial strains separated from traditional salted fish

YOU Gang1，2，WU Yan-yan2，*，LI Lai-hao2，YANG Xian-qing2，CHEN Sheng-jun2
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Lab of Aquatic Product Processing of Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

In order to select good starter cultures suitable for pickled fish processing，the fermentation properties of five kinds of lactobacillus separated from traditional salted fish，which included Lactobacillus plantarum（Lp），Pediococcus pentosaceus（Pp），Leuconostoc mesenteroides（Lm），Lactobacillus acidophilus（La） and Lactobacillus brevis（Lb）was studied.Five strains were screened by the experiments of biochemistry properties，characters of tolerating NaCl，the ability to produce acid，the growing curve of different temperatures and the antagonism among them.The results showed that five bacterial strains produced acid but no gas，mucus，H2O2，ammonia and H2S.The five strains could tolerate salinity of 8%to 12%，acid production was basically stable in 24h，the growth curves were similar and the optimum growth temperature at about 30℃. Antagonistic tests among them showed that La and Lm，La and Lp，Pp and Lm had the antagonistic action，but to a lesser extent antagonism，they could still meet the requirements of mixed fermentation for salted fish.The study provided a theoretical basis for establishing a quick-cured processing technology in the next step.

salted fish；lactic acid bacteria；fermentation property

TS254.4

A

1002-0306（2014）10-0220-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.041

2013－08－29 *通訊聯系人

游剛（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：生物法改進傳統腌干魚類加工技術。

國家自然科學基金項目（31371800）；中國水產科學研究院基本科研業務費資助（2013A1001）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201101I01、A201201I04）。