牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿理化特性的研究

趙 欣，李貴節

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿理化特性的研究

趙 欣，李貴節*

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067）

探討了牦牛酸乳分離乳桿菌（LFYY）發酵豆漿的理化性質。LFYY在人工胃液中存活率和在膽鹽中的生長率為保加利亞乳桿菌（LB）的大約4倍和7倍。在6h和12h發酵后，LFYY發酵豆漿的pH高于混合菌（LM，LFYY∶LB=1∶1）發酵豆漿，LB發酵豆漿為最低。這些發酵豆漿的酸度呈現和pH相反的趨勢。當發酵到6h和12h時，LM發酵豆漿中的總菌數高于LFYY和LB發酵豆漿。LFYY發酵豆漿中的氨基酸態氮和活性大豆異黃酮（大豆黃素和金雀異黃素）接近于LM發酵豆漿，顯著高于LB發酵豆漿（p＜0.05）。LFYY和LM發酵豆漿的感官品質也優于LB發酵豆漿。從實驗結果可以看出，LFYY發酵豆漿的品質優于LB發酵豆漿，混合菌可以提高發酵豆漿的品質，牦牛酸乳分離乳桿菌有利于發酵豆漿的生產。

豆漿，牦牛酸乳分離乳桿菌，氨基酸態氮，大豆異黃酮

乳桿菌作為細菌的一科，已經被廣泛應用在食品工業中，除了我國傳統的食品，如泡菜、榨菜、腌菜和釀酒等的生產技術外，酸乳這一深入人們生活的食品也是利用桿菌進行生產制作的[1-2]。我國工業中生產酸乳所用的發酵菌絕大部分是來自于國外，現在已經逐步對我國傳統酸乳制品中的微生物進行分離利用，乳桿菌作為發酵酸乳中常見的菌種，現已有部分乳桿菌從我國傳統酸乳中被分離出來[3]。大豆中蛋白質含量高，含有鈣、鐵、鋅等微量元素，同時發酵豆漿中的乳酸菌能抑制腸道中腐敗菌的生長和繁殖，能調節腸道功能正常活動[4]。而篩選生長繁殖力強、耐酸性好、發酵活力高的優質乳酸菌能進一步加強發酵豆漿的營養價值，增強其品質[5]。

牦牛乳具有營養成分含量高的特性，被視為“天然濃縮乳”，是川藏高原地區人民的一種重要的食品[6]。利用牦牛乳的優質品質，采用川西牧區高海拔，氣溫低，溫差大，紫外線輻射強的特殊生態環境生產的牦牛酸乳也具有很高的品質，并且分離出的微生物也具有特定的性質，區別于同類的一般微生物[7-8]。本研究選用來自四川阿壩藏族羌族自治州的紅原縣牧民家庭的自然發酵牦牛酸乳中分離鑒定的一種乳桿菌為對象，同時選取工業上常用的保加利亞乳桿菌作為對照菌株，利用兩種菌種生產發酵豆漿，制成牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿，保加利亞乳桿菌發酵豆漿。同時為了更好地了解兩種菌種的發酵能力，采用平均混合的方式（1∶1混合），使兩種菌在數量相等的基礎上混合發酵豆漿，作為對照樣品和前兩種豆漿進行對比。分析三種發酵豆漿的理化特性，為充分利用牦牛酸乳中分離微生物運用到工業生產中打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆漿 選用黑龍江農墾總局2012年產優質黃豆，用涼水浸泡12h打漿后用紗布過濾后得發酵前豆漿原汁；保加利亞乳桿菌 購自于中國工業微生物菌種保藏管理中心；分離乳桿菌 四川阿壩藏族羌族自治州的紅原縣自然發酵牦牛酸乳中分離鑒定的一種耐酸性最強的乳桿菌；甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純） 重慶市品譽化工有限公司；MRS培養基 上海艾研生物科技有限公司；大豆黃素、金雀異黃素標準品 美國Sigma公司。

LS-B75L型高壓蒸氣滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司；WPL-30型恒溫培養箱 江東精密儀器有限公司；MeterLab PHM210型pH計 法國Radiometer-Analytical SAS公司；VS-15CFN型離心機 韓國Vision科學株式會社；UV-1750型紫外分光光度計 日本島津公司；Waters 2487型高壓液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種耐受人工胃液的測定 將0.2%的NaCl、0.35%的胃蛋白酶溶解與1mol/L HCl混合后調整pH到3.0配制成人工胃液，滅菌后備用。取5mL菌株培養液，倒入已滅菌10mL離心管中，3000r/min離心10min后收集菌體，再加入5mL滅菌生理鹽水混合均勻配制成菌懸液，取配制好的菌懸液1mL與9mL的人工胃液混合，搖勻，置于恒溫振蕩器中培養（37℃，300r/min），并分別在0h和3h取樣，用MRS瓊脂培養基傾注37℃培養48h[9]。用平板計數法測定活菌數，按公式：存活率（%）=測定活菌數/0h的活菌數×100，計算其存活率。

1.2.2 菌種耐受膽鹽的測定 將菌種5mL按2%的接種量分別接種于含0.0%的Oxgll和1.0%的Oxgll（W/V）的MRS-THIO培養基（MRS培養基中加0.2%的巰基乙酸鈉）。在恒溫振蕩器中37℃培養24h后，以空白培養基為對照（未接種的MRS-THIO培養基），在600nm處分別測定上述不同濃度培養基的OD值[9]，按公式：膽鹽耐受力（%）=含膽鹽的培養基的OD值/空白培養基的OD值×100，計算菌株對膽鹽的耐受力。

1.2.3 pH和總酸度的測定 用pH計測定發酵豆漿的pH。取發酵豆漿20mL后用0.1mol/L NaOH滴定至pH=8.3，計算樣品的總酸度。公式如下：

酸度=V1×C×0.09×100/V2

式中∶C為滴定NaOH的濃度（0.1mol/L）；V1為滴定用NaOH的量（mL）；V2為樣品量（mL）。

1.2.4 活菌數測定 在發酵進行到6、12h時吸取發酵豆漿，梯度稀釋后選取稀釋106倍的菌液與MRS培養基混合均勻后傾注平板，分別測定各組菌落形成單位（CFU/mL）。

1.2.5 氨基酸態氮的測定 取樣品20mL采用甲醛值法進行氨基酸態氮含量的測定[10]。

1.2.6 活性異黃酮含量的測定 以Kromasil C18色譜柱（4.6mm×25mm，5μm）；流動相∶40%甲醇；流速為1.0mL/min；檢測器靈敏度為0.02AUFS；檢測波長為260nm；柱溫為50℃；進樣量為20μL的色譜條件進行測定。分別將大豆黃素和金雀異黃素標準品用80%（V/V）乙醇溶解，配制成濃度為0.002～0.020g/L標準溶液。取標準溶液20μL注入六通閥中，測定峰面積。求得回歸方程為：Y大豆黃素=148338+1．70×108X（r= 0．999）；Y金雀異黃素=-316706+4.20×108X（r=0.995），由此得到標準曲線。

在發酵進行到6、12h時吸取發酵豆漿樣品100mL，4000r/min離心得到上清，在80℃烘箱中干燥。干燥物用200mL的80%（V/V）乙醇80℃恒溫水浴中回流提取2h，回流提取兩次。合并提取液，減壓蒸干，用無水乙醇定容至10.00mL作為待測液，將待測液測定后對照標準曲線得到含量值。

1.2.7 感官評價 對發酵豆漿的感官性質采用感官定量分析法，以9分評分制進行感官評價。30名經過感官評價的感官評價員分別對水豆豉樣品的光澤度、大豆香氣、細膩感、粘稠感、豆腥味、香甜味、酸澀味、綜合口感和總體評價進行評分[11]，然后將測試樣品的標號隨機改變后重復進行3次評價，得到最終評分。評分標準為∶極不喜歡或極弱（1分），不喜歡或較弱（3分），可接受或中等（5分），喜歡或強烈（7分），極喜歡或極強烈（9分）。

1.3 數據統計

使用SAS統計軟件對所得到重復3次實驗的數據采用one-way ANOVA法分析各組數據結果之間是否存在統計學差異（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同乳桿菌耐受人工胃液和膽鹽的比較

部分乳桿菌能作為益生菌存在于人體腸道里成為正常腸道菌的組成部分，這部分作為益生菌的乳桿菌能在人體胃和小腸前段存活[12]，發酵豆漿中的乳桿菌耐受胃液的能力可以作為檢測發酵豆漿有益功效的一個指標。由表1可知，通過取樣檢測后可以看到在pH3.0人工胃液中牦牛酸乳分離乳酸乳桿菌的存活率大大高于商業用保加利亞乳桿菌，可見牦牛酸乳分離乳桿菌的抗胃酸性更強，更有利于起到益生菌的功效。在膽汁中的存活率也是衡量益生菌的一個重要方面[13]，膽鹽膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合而形成的鈉鹽或鉀鹽，通過檢測耐受膽鹽的能力可以判斷益生菌適應膽汁的程度。通過取樣檢測后可以觀察到牦牛酸乳分離乳桿菌在1.0%膽鹽下的生長率達到商業用保加利亞乳桿菌5倍以上，從中看出牦牛酸乳分離乳桿菌具備很強的耐受膽鹽能力，且遠高于保加利亞乳桿菌，可以作為益生菌使用。

表1 不同菌種耐胃酸和膽鹽的能力Table 1 Ability of resistance to gastric acid and cholate by different kinds of strains

2.2 不同菌種發酵豆漿的pH和總酸度

由表2可知，新鮮未發酵的豆漿加入菌種后的接近中性，經過6h發酵后，pH和總酸度均發生變化，發酵后的三種豆漿的pH都低于未發酵豆漿，呈顯著差異（p＜0.05）。牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿的pH顯著高于混合菌發酵豆漿，保加利亞乳桿發酵豆漿的pH最低（p＜0.05）。12h發酵后各菌種發酵后豆漿的pH表現出和6h發酵豆漿同樣的趨勢，牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿的pH最高，高于混合菌發酵豆漿，商業用保加利亞乳桿發酵豆漿的pH最低，并且各菌種發酵的豆漿的pH明顯低于6h發酵豆漿（p＜0.05）。pH可以代表所檢樣品的酸堿環境，由于所有發酵豆漿的pH均低于7，所以發酵豆漿總酸度較未發酵豆漿有所提高。6h和12h發酵后，保加利亞乳桿菌發酵豆漿的總酸比相同發酵時間牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿明顯提高（p＜0.05），混合菌發酵豆漿的總酸度介于兩者之間，12h發酵的各組豆漿的總酸度都明顯高于6h發酵的豆漿（p＜0.05）。

表2 不同菌種發酵豆漿的pH和總酸度Table 2 The changes of pH and total acidity in different strains fermented soybean milk

2.3 不同菌種發酵豆漿的活菌數

通過觀察發酵內活菌數量可以判斷豆漿的發酵程度強弱[14]。通過測定可以看到經過6h發酵后牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿內的活菌數高于保加利亞乳桿菌發酵豆漿內活菌數，但是大大小于混合菌種發酵后豆漿內的活菌數（圖1）。經過12h發酵后各菌種發酵豆漿內的活菌數都獲得增加，但是保加利亞乳桿菌發酵豆漿內的活菌數超過牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿，混合菌發酵豆漿內的活菌數依舊最高。牦牛酸乳分離乳桿菌在最初6h內增長速度高于保加利亞乳桿菌，但是6h后降低，這可能是由于牦牛酸乳分離乳桿菌為適應低溫高海拔的環境，可能在長期適應過程中造成的分裂增殖速度減慢造成。混合菌由于多種類細菌間發生協同效應，相互創造有利的生存條件，生長增值過程更快[15]，本研究中混合菌發酵時也出現了相似的結果。

圖1 不同菌種發酵豆漿的活菌數Fig.1 The viable counts in different strains fermented soybean milk

2.4 不同菌種發酵豆漿的氨基酸態氮含量

發酵產品中一些特定成分的含量對產品的風味有很大的影響，氨基酸態氮的含量可表示大豆產品中鮮味的程度[16]。經過乳桿菌發酵后的豆漿中氨基酸態氮含量較未發酵豆漿有所提高，各組發酵豆漿12h發酵時比6h發酵時氨基酸態氮含量也有所提高（圖2）。牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿中的氨基酸態氮含量低于混合菌發酵豆漿，高于保加利亞乳桿菌發酵豆漿（p＜0.05）。牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿中pH高于保加利亞乳桿菌發酵豆漿，由于高pH可增加氨基酸轉化率，生成更多氨基酸態氮[17]，所以牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿中氨基酸態氮含量較高；混合菌發酵豆漿的pH也較高，并且由于混合菌發酵活菌數增加，發酵程度更為強烈，氨基酸態氮含量獲得了最大的提高。

圖2 不同菌種發酵豆漿的氨基酸態氮含量Fig.2 The content of amino ammonia type nitrogen in different strains fermented soybean milk

2.5 不同菌種發酵豆漿的大豆異黃酮含量

樣品處理后，于色譜條件下進樣測定，從回歸方程中求得樣品的濃度并換算出樣品中大豆黃素和金雀異黃素的含量。在發酵過程中最初6h內各菌種發酵的豆漿內的大豆黃素含量都急速增加，特別是混合菌發酵豆漿的大豆黃素含量增加得最為明顯，牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿中的的大豆黃素也發生明顯改變，起含量增加的趨勢僅略微低于混合菌發酵豆漿，商業用保加利亞乳桿菌發酵豆漿的大豆黃素含量也出現增加，但較另外兩種發酵豆漿有一定差距。6～12h發酵過程中三種發酵豆漿隨著發酵的進行，大豆黃素含量任然緩慢增加，但是增加的幅度較初始6h大幅度下降（圖3）。同時由圖4可以看到，金雀異黃素和大豆黃素一樣，在發酵豆漿中的含量隨著發酵過程的進行而增加，最初6h內各組豆漿增加的趨勢也是大幅度增加，且混合菌發酵豆漿增加的趨勢高于牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿，保加利亞乳桿菌發酵豆漿的增加的趨勢較另兩種豆漿緩慢。6h后三組豆漿金雀異黃素增加的趨勢趨于停止。異黃酮具有降低膽固醇，預防心血管疾病和癌癥的作用，其中大豆黃素和金雀異黃素屬于大豆異黃酮中游離型苷元類型，可以直接被人體吸收利用，是大豆異黃酮中最主要的功能性成分類型[18]。本研究中牦牛酸乳分離乳桿菌和混合菌發酵豆漿具有較高的游離型苷元大豆異黃酮，作為功能性食品其功能性成分含量高于商業保加利亞乳桿菌單一菌種發酵豆漿。單一菌種發酵食品時酶作用簡單，多菌種混合發酵時酶系復雜，采用合理的菌種混合比例可以加強菌種間相互作用，產生更多的發酵有益成分[19]，本文中也得出了相似的結果。

圖3 不同菌種發酵豆漿的大豆黃素含量Fig.3 The content of daidzein in different strains fermented soybean milk

圖4 不同菌種發酵豆漿的金雀異黃素含量Fig.4 The content of genistein in different strains fermented soybean milk

2.6 不同菌種發酵豆漿的感官評價

感官評價員對不同菌種發酵豆漿進行感官評價（圖5），經過統計后可以觀察到在光澤度、大豆香氣、細膩感、粘稠感、香甜味、綜合口感和總體評價上牦牛酸乳分離乳桿菌和混合菌發酵豆漿較為接近，且明顯高于商業保加利亞乳桿菌單一菌種發酵豆漿。保加利亞乳桿菌發酵豆漿的豆腥味和酸澀味較其他兩種發酵豆漿更為明顯。可見牦牛酸乳分離乳桿菌和加入其的混合菌發酵的豆漿具有更好的感官品質。

圖5 不同菌種發酵豆漿的感官評價Fig.5 The sensory evaluation of different strains fermented soybean milk

3 結論

從實驗結果可以看出，牦牛酸乳分離乳桿菌的耐受人工胃液和膽鹽的能力遠強于一般商業保加利亞乳桿菌，分別用這兩種菌種單獨發酵和混合發酵的豆漿之間的品質也存在差異。牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿的pH和活菌數在6h發酵時均顯著高于商業保加利亞乳桿菌發酵豆漿，發酵到和12h時低于保加利亞乳桿菌發酵豆漿，在6h和12h發酵時酸度則明顯低于保加利亞乳桿菌發酵豆漿，混合菌發酵的pH和酸度介于兩者之間，活菌數最多（p＜0.05）。由此看出牦牛酸乳分離乳桿菌具有更強的活性，這些活性影響了豆漿中主要的大豆異黃酮的含量，牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿的活性大豆異黃酮（大豆黃素和金雀異黃素）含量明顯高于商業保加利亞乳桿菌發酵豆漿，而混合菌發酵豆漿因為多菌種的聯合作用產生了最多的活性大豆異黃酮，成為品質最好的產品。由于理化性質等原因產生的品質差異對口感產生的影響與感官實驗結果相對應，理化性質更好的豆漿其口感也更好。綜合實驗結果可以得出牦牛酸乳分離乳桿菌菌種能力由于商業保加利亞乳桿菌，在其他發酵條件都相同的狀況下，牦牛酸乳分離乳桿菌發酵豆漿的理化特性各指標較保加利亞乳桿菌除酸度外均顯著升高（p＜0.05），采用該菌種生產的發酵豆漿品質突破傳統菌種發酵豆漿到達一個新的水平，可以開發利用生產出一種品質優秀的全新產品。混合菌發酵豆漿的品質較單一菌種發酵更優，其聯合發酵產生更好品質的機制有待進一步研究。

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Study on Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt fermented soybean milk in physicochemical properties

ZHAO Xin，LI Gui-jie*
（Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China）

The present study aimed to investigate the physicochemical properties of Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt（LFYY）fermented soybean milk.The artificial gastric juice survival and growth rate in bile salt of LFYY were about four and seven times higher than Lactobacillus bulgaricus（LB）.The pH of LFYY fermented soybean milk was higher than mixture bacterial strains（LM，LFYY∶LB=1∶1）fermented one，and LB fermented soybean milk showed the lowest pH after 6 and 12h fermentation.Total acidity of these fermented soybean milk showed the opposite trends with the pH.In the fermentation process at 6h and 12h，the counts of Lactobacillus in LM fermented soybean milk were more than LFYY and LM fermented soybean milk.The amino type nitrogen content and activity of isoflavones（daidzein and genistein）in LFYY fermented soybean milk were close to LB one，and more than LM one（p＜0.05）.The sensory qualities of LFYY and LM fermented soybean milk were also better than LB one.From there results，LFYY fermented soybean milk showed the better qualities than LB one，the LM could increased the qualities of fermented soybean milk.Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt is good for fermented soybean milk produce.

soybean milk；Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt；amino type nitrogen；isoflavone

TS201.1

A

1002-0306（2014）10-0224-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.042

2013－08－01 *通訊聯系人

趙欣（1981-），男，博士，教授，研究方向：食品營養和功能性食品開發。

2013年重慶高校創新團隊建設計劃資助項目（KJTD201325）；重慶市教委科學技術研究項目（KJ131503）；重慶第二師范學院教改項目（JG20132206）。