干擾LOX基因對喉鱗癌Hep-2細胞增殖、侵襲及放療敏感性的影響*

董凱峰 呂 欣 宋冬梅 劉志明 薛海濤 張翠紅

喉鱗癌是臨床較常見、病情發展迅速且治愈率較低的惡性腫瘤之一。探討喉鱗癌增殖、侵襲的機制，尋找影響喉鱗癌治療效果的相關基因，對臨床治療喉鱗癌具有重要意義。賴氨酰氧化酶（lysyl oxi?dase,LOX）屬于糖蛋白，主要負責細胞外的膠原蛋白、結構性基質蛋白以及彈性蛋白賴氨酸源性交聯的產生[1]。較早的研究發現，LOX在一些癌組織中表達下調，能抑制細胞惡性轉化，具有抑制腫瘤的功能。但近期研究揭示，LOX對癌細胞侵襲、轉移具有明顯的促進作用[2-3]。以上提示LOX可能具備抑制腫瘤和促進轉移的雙重功能，但具體機制仍不清楚。RNA干擾具有高效性和高度特異性，其可阻斷真核細胞中相關基因產物的表達，是近年來基因組學研究的熱點。本研究通過阻斷人喉鱗癌Hep-2細胞LOX mRNA及蛋白的表達，檢測其對LOX、增殖細胞核抗原（Ki-67、PCNA）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表達，細胞凋亡及放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及細胞培養 喉鱗癌Hep-2細胞系購自北京協和醫學院生物所。細胞培養條件：10%胎牛血清，青霉素0.1 μU/L，鏈霉素0.1 g/L，RPMI 1640培養基，于37℃，5% CO2環境下培養，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.1.2 抗體及試劑 LOXsiRNA、LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。免疫細胞化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；轉染試劑盒購自CST公司；PI購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及轉染 將Hep-2細胞分為3組，空白對照組（正常培養對照）、陰性對照組（轉染試劑對照）、轉染組（轉染LOXsiRNA）；同時按照小RNA（siRNA）轉染試劑盒說明進行轉染。轉染前將Hep-2細胞以5×104/孔鋪于6孔板中，無血清無抗生素同步培養12 h。轉染試劑同細胞共孵育4～6 h后吸棄，加入正常培養基培養24 h。

1.2.2 Real-time PCR法檢測Hep-2細胞中的LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，取50 ng總RNA進行逆轉錄。Real-time PCR操作按照試劑盒說明進行，基因引物見表1。每一樣品設3個復孔進行擴增。條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，28次循環。讀取Ct值，計算3組的△Ct值=Ct目的基因–Ctβ-actin，△△Ct＝轉染組△Ct–空白對照組△Ct，以2-△△CT代表目的基因的相對表達量。

1.2.3 Western blot法測定Hep-2細胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達 取Hep-2細胞總蛋白30 μg，與5×上樣緩沖液按4∶1混合，100℃煮10 min，與蛋白質Marker一起上樣，經12%SDS-PAGE分離膠電泳，再電轉至PVDF膜上，TBS配制5%的脫脂奶粉溶液封閉1.5 h，抗體 1∶500 4℃孵育過夜，1×TBST溶液洗滌3次，每次10 min，PVDF膜與HRP標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h后，1×TBST溶液洗滌3次，每次10 min，ECL顯色。實驗重復3次，取其平均值。

1.2.4 MTT法檢測不同劑量射線對Hep-2細胞生存率的影響 對數生長期Hep-2細胞接種至96孔板，分別給予不同劑量X射線（0、3、6、9、12、15、18 Gy）照射24 h后收取細胞，每組5個復孔，每孔加入10 μL MTT(5 g/L，無血清RPMI 1640配制后過濾除菌)37℃培養4 h后終止，每孔加入DMSO 2 000 μL，微板儀振蕩10 min后，酶標儀檢測490 nm各組吸光度（A）值。細胞生存率=（A轉染組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）。

Table 1 The primer sequences of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9,LOX and β-actin gene表1 PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX和β-actin基因引物序列

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將Hep-2細胞分為空白對照組、陰性對照組、轉染組、放療組、轉染+放療組。轉染方法同1.2.1。放療組為給予劑量為12 Gy X射線照射細胞；轉染+放療組為轉染12 h后，給予12 Gy X射線照射細胞，繼續培養24 h后收集細胞；1 000 r/min離心5 min，棄去上清；4℃預冷PBS洗2遍，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入70%冰乙醇重懸固定，-20℃保存；上機前1 000 r/min離心5 min，棄乙醇，4℃預冷PBS洗3次；4℃預冷500 μL PBS制成細胞懸液，加RNaseA消化(終濃度50 mg/L)，4℃放置1 h，細胞濃度調整為1×106個/mL，加入0.1 g/L PI 500 μL，避光20 min，1 000 r/min離心5 min，4℃預冷PBS重懸，上機檢測細胞凋亡，每個樣本檢測1×104個細胞。

1.3 統計學方法 SPSS 16.0統計軟件進行處理，計量資料數據用±s表示，多樣本均數比較采用F檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染LOXsiRNA對Hep-2細胞PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX表達的影響 轉染組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX mRNA及蛋白表達水平較陰性對照組和空白對照組明顯下調(P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義，見表2、3，圖1。

2.2 不同劑量的X射線對Hep-2細胞生存率的影響 不同劑量（0、3、6、9、12、15、18 Gy）X射線作用Hep-2細胞24 h，細胞生存率分別為(99.12±1.42)%、(90.32±1.32)%、(81.20±2.11)%、(73.35±1.23)%、(54.13±1.25)%、(51.26±2.42)%、(50.13±2.12)%，呈逐漸下降趨勢(F=20.126，P＜0.05)，劑量為12、15、18 Gy時，細胞生存率明顯低于劑量為9 Gy時，但3種劑量（12、15、18 Gy）組間差異無統計學意義，見圖2。

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相對表達量比較 （±s）

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相對表達量比較 （±s）

＊P＜0.05；a與轉染組比較，P＜0.05

PCNA Ki-67組別

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相對表達量比較 （±s）

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相對表達量比較 （±s）

＊P＜0.05；a與轉染組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉染組F PCNA 60.21±1.99a 55.14±0.91a 21.22±0.31 22.186＊Ki-67 59.32±2.11a 50.31±1.61a 22.13±0.12 36.391＊組別空白對照組陰性對照組轉染組F MMP-2 55.31±0.32a 53.22±0.87a 19.31±0.21 24.249＊MMP-9 54.43±0.67a 50.02±0.43a 21.41±0.54 30.173＊LOX 51.12±1.21a 49.11±1.31a 20.30±0.21 24.197＊

Figure 1 Results of Western blot analysis for protein expressions of LOX,Ki-67,PCNA,MMP-2 and MMP-9 in three groups of transfected Hep-2 cells圖1 Western blot法分析3組Hep-2細胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達結果

Figure 2 The survival ratio of Hep-2 cells after different doses of radiation圖2 不同劑量射線作用24 h對Hep-2細胞生存率的影響

2.3 轉染LOXsiRNA對Hep-2細胞凋亡指數的影響 5組細胞凋亡指數（%）差異有統計學意義（F= 10.267，P＜0.05）。轉染組（16.21±1.17）明顯高于陰性對照組（4.95±1.12）和空白對照組(5.01±1.02)，空白對照組與陰性對照組差異無統計學意義。轉染+放療組（79.11±1.26）明顯高于陰性對照組、空白對照組、放療組（43.21±2.12）及轉染組，差異均有統計學意義。

3 討論

喉鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤的侵襲、轉移是造成患者死亡的主要因素，在這個過程中，許多腫瘤相關的增殖轉移基因參與調控，如Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9，而最近的研究揭示，LOX對癌細胞轉移存在明顯的促進作用，LOX的生物學功能是作用于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的膠原和彈性纖維，催化產生一系列復雜反應，最終形成膠原與彈性纖維間的共價交聯[4]，即通過此共價交聯，發揮維持基底膜完整性，LOX的產生和調節在保持ECM的發育、成熟及結構的完整性方面起重要作用[5-6]。Erler等[2]研究指出LOX由缺氧誘導因子（HIF）-1α調控，與人類乳腺及頭頸部腫瘤的缺氧有關。抑制LOX能降低原位乳腺癌在荷瘤小鼠模型中的轉移，而腫瘤細胞自身可通過黏著斑激酶(focaladhesin kinase,FAK)的活性及細胞與基質的黏附，同時分泌LOX，可誘導缺氧環境下的人類癌細胞的侵襲。該研究還證明，缺氧環境下LOX mRNA及蛋白的含量明顯增加，并且已分泌的LOX活性明顯提高，從而促進了細胞侵襲性遷移，利于腫瘤的轉移擴散。另外，由于LOX活性的增加及細胞的遷移導致ECM的軌跡被改變，提供了一條直接通路，使后續的細胞更易于移動，因此增加了細胞的遷移和侵襲[7-8]。

為進一步探討LOX在喉鱗癌中可能發揮的作用，本研究采用RNA干擾技術，將LOX siRNA轉染至喉鱗癌Hep-2細胞，觀察LOX基因對喉鱗癌Hep-2細胞生長、凋亡以及增殖侵襲相關蛋白Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的影響。結果顯示，轉染組的LOX mRNA和蛋白表達受到顯著抑制，表達水平明顯低于陰性對照組和空白對照組，細胞凋亡指數顯著高于陰性及空白對照組，說明LOX表達越低，Hep-2細胞凋亡指數越高。另外，本研究結果顯示，轉染LOX siRNA后，Ki-67、PCNA蛋白的表達均明顯降低，提示可能因下調LOX基因而影響Ki-67、PCNA的表達，Ki-67、PCNA的表達與細胞周期密切相關，在G1期時表達增加，在S期時明顯表達，G2和M期達到峰值，在細胞有絲分裂后迅速下降，因此，Ki-67、PCNA被認為是一個能可靠地反映細胞增殖活性的客觀指標[9-11]。腫瘤的浸潤與轉移的關鍵問題是ECM成分的降解，而MMPs能降解ECM，在惡性腫瘤的浸潤和擴散中起重要作用。MMP-2是所有MMPs中分布最廣的，當細胞惡變時，MMP-2常升高。MMP-9是MMPs中分子質量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的ECM和基膜，使瘤細胞可沿著缺失的基膜向周圍組織浸潤，促進腫瘤侵襲和轉移；另一方面可通過促進腫瘤內毛細血管新生，使腫瘤生長、擴散[12]。本研究結果顯示，轉染LOX siRNA后，Hep-2細胞中MMP-2、MMP-9表達明顯減弱，提示降低LOX表達可使這些相關基因的表達下降，以此來調控腫瘤細胞的生長和增殖，達到治療腫瘤的目的。然而相關基因在腫瘤發生、發展的不同階段是如何相互影響的機制目前尚不清楚，可能與癌轉移的生物學特性不同有關，有待于進一步研究。

X射線導致細胞死亡的一個主要途徑是激活細胞的凋亡機制[13]。細胞凋亡是在基因控制下，通過主動的生化過程而發生自殺死亡的現象。細胞凋亡程序的修復可提高腫瘤細胞對放療的敏感性。本研究結果顯示，經劑量為12 Gy射線照射時，轉染聯合放療組Hep-2細胞的凋亡指數明顯高于陰性對照組、空白對照組、放療組及轉染組，提示LOX siRNA轉染后具有增強放療效果、抑制腫瘤細胞生長的作用，是增強放療敏感性的一個潛在的分子靶位點，有可能在不改變放療放射劑量前提下，增強放療效果，為以后在基因水平上改變腫瘤細胞的放療敏感性提供了線索。

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