microRNA-21通過促進成纖維細胞的增殖和分化調節心肌梗死后的心臟重塑

郭 東 張閩紅 肖清萍 劉建文

心肌梗死（心梗）是心臟衰竭最常見的病因之一，發病兇險，致殘率和致死率均高，因此研究如何改善心梗后心臟的修復能力具有重要的臨床價值。miRNA（miR）是一類非編碼的小分子RNA，通過抑制靶基因的翻譯過程，參與許多重要的生物學過程[1]。研究表明miR-21在急性心肌缺血的早期病理過程中起著重要的調節作用[2]。過表達miR-21可以減少腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導的心肌細胞凋亡[3]。本研究采用小鼠心肌梗死模型，檢測心梗交界區心臟組織miR-21的表達情況，同時利用miR-21的模擬物（miR-21 mimic）轉染小鼠原代心臟成纖維細胞，觀察過表達miR-21對心臟成纖維細胞增殖與分化的影響，為促進心梗后心臟的修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質量相近的C57/BL6小鼠，SPF級，雄性，體質量（23±3）g，購自南京大學模式動物研究所。

1.2 試劑和儀器 RNA反轉錄試劑盒和SYBR試劑（日本TAKARA公司）；DMEM高糖培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；脂質體Lipfectamine 2000（美國in?vitrogen公司）；化學修飾的miR-21 mimic（上海吉瑪生物科技有限公司）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（美國ABI公司）；蛋白提取試劑盒（碧云天）；α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、小鼠Smad同源物7（Smad7）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Santa Cruz,USA）；EdU細胞增殖檢測試劑盒（廣州市瑞博生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 按照隨機數字表法分為假手術組和心肌梗死組，每組20只。假手術組開胸但不結扎左冠狀動脈；心肌梗死組阻斷左冠狀動脈前降支7 d。2組均為普通飼料飼養，自由飲水。

1.3.2 小鼠心梗模型的建立 心梗模型制作參照文獻[4]進行。胸骨左緣第2～4肋開胸，以左冠脈主干為標志，在左心耳下方2 mm處進針，6-0號絲線結扎左前降支，當結扎區域變白，心電圖2個以上的肢導聯出現ST段上抬0.2 mV則判斷為造模成功。

1.3.3 HE染色 處死小鼠，用含有肝素的生理鹽水灌洗以去除心臟組織的血液。取心臟，用10%福爾馬林固定組織，脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚切片，進行HE染色，觀察心肌梗死后心肌細胞存活及炎癥細胞浸潤情況。

1.3.4 qRT-PCR檢測miR-21的含量 應用Trizol法提取各組小鼠心臟組織的RNA，用TAKARA反轉錄試劑盒，利用莖環結構引物特異性反轉miR-21和U6。第一步引物退火，取2 μg RNA與1 μL miR-21（100 mg/L）和1 μL U6（100 mg/L）特異性莖環結構引物混合，反應條件為70℃10 min，4℃10 min。第二步合成cDNA第一鏈，在混合物中分別加入10× buffer、2 μL MgCl2（20.8 mol/L）、1 μL反轉錄酶，補水至20 μL，充分混勻，反應條件為37℃1 h，4℃10 min。生成的cD? NA取1μL，與10 μL 2×SYBR混合，再加入7 μL水和1 μL上、下游引物，混勻為20 μL反應體系，反應條件為95℃5 min，95℃15 s，60℃60 s，40個循環。miR-21的表達水平用Cq值（熒光信號達到設定閾值所經的循環數）表示，內參為U6。引物序列見表1。

Table 1 The stem-loop and PCR primers of different genes表1 目的基因莖環引物及PCR引物序列

1.3.5 小鼠成纖維細胞的提取 無菌條件下取出心臟于6 cm培養皿中，D-hank’s液漂洗，剪碎心臟放入15 mL離心管中，加入5倍體積0.05%胰酶，37℃水浴5 min，反復吹打、靜置，待自然沉降后棄去上清液。沉淀加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶Ⅱ混合液，反復吹打約10 min，離心取沉淀后以10 mL含20%胎牛血清的DMEM培養液重懸，接種于6 cm培養皿中。60～90 min后更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養液。

1.3.6 miR-21 mimic的轉染 轉染前1 d，胰酶消化成纖維細胞，接種至6孔板中，使轉染前細胞濃度能夠達到30%～50%。實驗分3組：隨機對照組、空白對照組和miR-21 mimic組。各組分別在50 μL Opti-MEM加入1.25 μL PBS、陰性對照儲存液和miR-21 mimic儲存液（20 μmol/L），室溫孵育5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL lipo2000，溫和混勻并室溫孵育5 min。將以上兩液體溫和混勻，室溫孵育20 min。將混合液加入含有細胞的1 mL培養基的培養孔中，溫和混勻，培養4～6 h后，將孔中含mimic-lipo2000混合液的培養基移去，更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養液。細胞培養24 h后，采用熒光定量PCR技術檢測miR-21的含量。

1.3.7 Western blot法測定成纖維細胞α-SMA及Smad7蛋白的表達 心臟原代成纖維細胞培養1周后，按照試劑盒說明提取蛋白，并測定蛋白濃度。在10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE電泳。電泳結束后用半干轉電轉移法將凝膠中蛋白轉至硝酸纖維素膜。轉膜后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，然后分別加入相對應的一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜。第2天膜浸于一抗溶液中，室溫平衡1 h后，洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜3次，每次10 min。利用辣根過氧化物酶HRP-ECL化學發光法檢測蛋白條帶，不做放射自顯影。以GAPDH為內參。

1.3.8 EdU檢測成纖維細胞的增殖 成纖維細胞以（4×103～1×104）/孔接種于96孔板中，實驗分組同1.3.6，每組設3個復孔。于轉染后2 d每孔加入50 μmol/L EdU試劑100 μL，于37℃5%CO2條件下孵育2 h；棄培養液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛，室溫孵育30 min；棄固定液，每孔加入50 μL 2 g/L甘氨酸，孵育10 min；棄甘氨酸溶液，每孔加入100 μL PBS，孵育5 min；棄PBS，每孔加入100 μL 0.5%Triton，孵育10 min，PBS沖洗1次；每孔加入100 μL 1×Apollo?染色反應液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應液；PBS沖洗1次；每孔加入10 μL 1×DAPI反應液，避光、室溫孵育10 min；在熒光顯微鏡下進行觀察及圖片采集。按下列公式計算細胞增殖率(%)=EdU陽性細胞數/DAPI陽性細胞數× 100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用t檢驗；多組均數間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 常規光鏡下可見心肌梗死組梗死區主要是膠原纖維和成纖維細胞，幾乎無存活心肌細胞；梗死交界區由心臟成纖維細胞和心肌細胞組成，且梗死區和交界區均有炎癥細胞浸潤，而遠端區主要是存活的心肌細胞，表明小鼠心肌梗死造模成功，見圖1。

Figure1 The myocardial tissue sections of HE staining（HE,×400）圖1 HE染色光鏡下心肌組織切片（HE,×400）

2.2 2組心臟梗死交界區miR-21的基因表達比較 與無梗死的假手術組（1.620±0.451）×10-4相比，心肌梗死組梗死交界區的miR-21的表達量（6.043± 0.231）×10-4明顯增加（t=12.102，P＜0.01）。

2.3 3組成纖維細胞中miR-21的基因表達及EdU陽性率比較 miR-21 mimic組成纖維細胞中的miR-21基因表達及EdU陽性率明顯高于隨機對照組和空白對照組（P＜0.01），而后2組差異無統計學意義，見表2。

Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細胞后miR-21基因表達及EdU陽性率比較 （±s）

Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細胞后miR-21基因表達及EdU陽性率比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，P＜0.01

組別隨機對照組（1）空白對照組（2）miR-21 mimic組（3）F n333 miR-21/U6（×10-4）1.143±0.064 1.017±0.201 4.839±0.705ab 15.418＊＊EdU陽性率（%）12.553±1.227 13.946±1.550 27.892±1.645ab 32.632＊＊

2.4 Smad7和α-SMA蛋白表達水平的變化 隨機對照組和空白對照組的成纖維細胞Smad7表達較強，miR-21 mimic組轉染成纖維細胞后Smad7的表達明顯下調，條帶灰度減弱。同時miR-21 mimic組α-SMA的表達顯著上調，條帶灰度增強。空白對照組與隨機對照組Smad7及α-SMA蛋白表達量無明顯差異，見圖2。

Figure 2 The expression of Smad7 and α-SMA in fibroblast after overexpression of miR-21 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測過表達miR-21后成纖維細胞Smad7和α-SMA蛋白的表達情況

3 討論

3.1 miR-21參與心梗后心臟的損傷和修復 目前由于臨床溶栓及急診經皮冠狀動脈腔內成形術的廣泛應用，已明顯減低了急性心肌梗死的死亡率。但心臟破裂作為急性心肌梗死的常見并發癥之一幾乎是致命性的，且其發生尚不可預測，嚴重威脅患者生命。心梗后心臟破裂的發生機制主要與心臟的重塑有關。已有文獻報道多種microRNA參與心臟重塑的病理過程[4]。miR-21是由單個基因編碼，在進化上高度保守的microRNA。Lagos-Quintana等[5]報道miR-21可以在心臟、小腸、脾臟等多種器官中表達。有研究證實，miR-21參與多種心血管疾病[6]。最新研究表明miR-21可通過調節轉化生長因子（TGF）-β受體Ⅲ（TGFβRⅢ）的表達調控心臟纖維化[7]。Yin等[8]發現小鼠心肌梗死24 h后，心肌梗死區miR-21表達顯著上調。Cheng等[9]在小鼠的心梗模型中證實上調的miR-21可明顯減少心肌梗死面積。本研究中，筆者成功構建小鼠心肌梗死模型，HE染色顯示梗死區心肌細胞基本消失，并且有大量炎癥細胞的浸潤。qRT-PCR結果發現miR-21在心肌梗死組梗死交界區表達較對照組顯著上調，表明miR-21參與心梗后心臟損傷和修復過程。

3.2 miR-21通過抑制Smad7基因激活成纖維細胞的增殖與分化 成纖維細胞的增殖與分化在心肌梗死后的心臟重塑過程中扮演重要角色。研究表明TGF-β信號通路是調控成纖維細胞的增殖與分化的主要信號通路[10]。本研究證實過表達miR-21可以明顯激活成纖維細胞的增殖和分化。Smad7基因是TGF-β信號轉導通路的抑制蛋白，它與細胞膜上TGF-β受體競爭性結合，阻斷TGF-β信號在胞漿內的傳導，下游信號紊亂是TGF-β信號轉導通路失活的機制之一[11]。而抑制TGF-β/Smads信號通路可以減輕糖尿病導致的腎臟纖維化[12]。在本研究中，筆者利用TargetScan 4.0預測到Smad7為miR-21的下游靶基因，結果表明在成纖維細胞中過表達miR-21可以明顯抑制Smad7的表達。因此推測在心梗模型下，miR-21通過抑制Smad7的表達，進而促進TGF-β對成纖維細胞的分化，最終改善了心臟的重塑。

綜上所述，在小鼠心肌梗死模型中，miR-21在梗死交界區表達明顯上調，通過抑制靶基因Smad7的表達，促進成纖維細胞的增殖和分化，進而促進心梗后心臟組織的修復，此結果為有效預防心梗后心臟破裂提供了新的線索和治療靶點。

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