成人隱匿性自身免疫性糖尿病早期血漿SERPING1的變化及意義*

秦 雯 張佳俐 夏 寧△

成人隱匿性自身免疫性糖尿病（latent autoim?mune diabetes in adult,LADA）以與糖尿病相關的自身抗體陽性為特征[1]。LADA患者胰腺β細胞自身免疫性破壞發生的速度較慢，使其早期血糖的增高有一個潛伏期。盡管LADA在發病初期與2型糖尿病（T2DM）很相似[2-3]，但就治療方法而言兩者應當有所區別[4-5]。因此，早期診斷LADA有重要的臨床價值。最近，有蛋白組學研究發現血漿C1酯酶抑制物（plasma protease C1 inhibitor,SERPING1）可能成為1型糖尿病（T1DM）的新的血漿標志物[6]。和T1DM一樣同屬自身免疫性糖尿病的LADA，其患者血漿中SERPING1的表達是否也有同樣趨勢尚鮮見報道。本研究旨在評價SERPING1與LADA的關系，進而探討SERPING1水平變化對LADA的早期預測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年8月—12月在我院內分泌門診就診的LADA患者58例，T1DM患者52例，T2DM患者65例納入本研究。上述糖尿病患者均符合2003年美國糖尿病協會（ADA）診斷標準，并且均為病程在6個月之內的早期患者。排除標準：（1）線粒體基因突變糖尿病患者。（2）青少年起病的成人型糖尿病患者。（3）其他原因所致糖尿病和妊娠期糖尿病患者。（4）其他自身免疫疾病患者。另選同期條件相匹配的健康志愿者83例為正常對照（NC）組。所有258例參與研究者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 受試者過夜禁食12 h，次日清晨空腹采肘正中靜脈血檢測空腹C肽（FCP）、空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平；繼而行饅頭餐試驗（食用100 g標準面粉制成的饅頭），5 min內食用完，從開始進食第一口饅頭起算時間，于進食饅頭餐2 h后取血檢測餐后2 h血糖（2 hPG）、餐后2 h C肽（2 hCP）水平。另留取部分空腹血標本以4℃恒溫離心機3 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80℃冰箱保存，統一檢測谷氨酸脫羧酶抗體（glutamic acid decarboxylase, GADA）及SERPING1水平。

1.2.2 一般實驗室指標檢測 HbA1c采用高效液相法，美國Bio-Rad公司D-10全自動糖化血紅蛋白儀測定；FPG、2 hPG采用葡萄糖氧化酶法，西門子公司ADVIA2400全自動生化儀測定；FCP、2 hCP采用化學發光法，美國DPC公司全自動化學發光免疫分析儀（IMMULATE-1000）測定；GADA使用北京北方生物技術研究所生產的酶聯免疫吸附測定（ELISA）診斷試劑盒自行集中測定（該試劑盒的結果判定標準為：Cutoff值=陰性對照平均光密度（OD）值×2.1；樣本OD值≥Cutoff值為陽性，＜Cutoff值為陰性）。

1.2.3 SERPING1檢測 使用武漢華美生物工程公司生產的人類SERPING1蛋白競爭法ELISA測量試劑盒，并在終止反應后15 min內、在450 nm波長下讀取OD值，各個復孔取平均值。運用回歸分析做擬合標準曲線，根據稀釋倍數計算出各樣品的實際濃度。

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS 16.0軟件包進行統計學分析。計量資料行正態性和方差齊性檢驗，再進行統計學分析，正態分布者采用（±s）表示，多組間樣本均數比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。偏態分布計量資料用中位數（M）表示，采用多個獨立樣本Kruskal-wal?lis秩和檢驗，統計量為χ2，組間多重比較采用數據編秩轉換后SNK-q檢驗。計數資料采用χ2檢驗。血漿SERPING1與其他指標的相關性采用Spearman相關分析。回歸分析采用多元逐步線性回歸分析法。采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析SERPING1早期預測LADA的診斷效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料的比較 各組性別構成、病程比較差異無統計學意義。LADA組年齡高于T1DM組（P＜0.05），而與其他各組比較差異均無統計學意義。LADA組與T1DM組、T2DM組、NC組的HbA1c、FPG、2 hPG、FCP、2 hCP指標間差異部分有統計學意義（P＜0.05），見表1。GADA作為糖尿病分型指標納入檢測，但組間比較因為LADA組、T1DM組GA?DA陰性為0，而T2MD組、正常組陽性為0，不宜行統計學分析，待以后數據資料增加后再行統計學分析。

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各組一般資料的基線水平 （±s）

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各組一般資料的基線水平 （±s）

表中數據描述方式為例或±s或M；＊＊P＜0.01；a與LADA組比較，P＜0.05

組別LADA組T1DM組T2DM組NC組F或χ2 n 58 52 65 83性別（男/女）32/26 28/24 37/28 48/35 0.245年齡（歲）37.2±5.1 12.2±3.8a 38.2±4.7 36.8±4.7 413.435＊＊病程（月）4.8±1.1 4.5±1.2 4.7±1.2 -0.819 HbA1c（%）8.2±0.8 8.6±0.8a 7.8±0.7a 5.1±0.4a 416.729＊＊組別LADA組T1DM組T2DM組NC組F或χ2 n 58 52 65 83 FPG（mmol/L）9.2±1.7 10.0±1.6a 9.0±1.2 5.1±0.7a 210.807＊＊2 hPG（mmol/L）15.8±1.5 17.0±1.9a 13.8±0.8a 6.1±1.1a 985.843＊＊FCP（μg/L）0.705 0.530a 1.87a 1.48a 204.547＊＊2 hCP（μg/L）1.3±0.2 1.0±0.2a 6.0±1.5a 5.6±1.9a 262.050＊＊GADA（+/-）58/0 52/0 0/65 0/83 -

2.2 各組SERPING1水平比較 LADA組、T1DM組、T2DM組、NC組血漿SERPING1（mg/L）分別為325.00±72.70、337.26±86.70、296.45±71.20、292.04± 58.46，4組間差異有統計學意義（F=5.991，P＜0.01），LADA組高于T2DM組、NC組（P＜0.05），而與T1DM組比較差異無統計學意義。

2.3 LADA組SERPING1與其他指標的關系 在LADA組SERPING1水平與FCP呈負相關（rs=-0.680），與HbA1c、FPG、2 hPG呈正相關（rs分別為0.550、0.547和0.476，均P＜0.05）。以血漿SERPING1為因變量，年齡、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP為自變量，行多元逐步線性回歸分析，因為LADA組樣本量較小，根據臨床經驗將年齡、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP作為自變量，逐個納入行多元逐步回歸分析，納入檢驗水準P＜0.1，排除標準P＞0.1所得結果，初步排除年齡和2 hCP。最終將其余5個指標作為自變量，行多元線性回歸分析，結果FCP進入回歸方程（P＜0.001）,見表2。

Table 2 The multiple regression analysis of SERPING1 and related factors in patients with LADA表2影響LADA患者SERPING1相關因素的多元回歸分析

2.4 血漿SERPING1對LADA的早期預測 采用ROC曲線分析SERPING1早期鑒別LADA和T2DM患者的效能，見圖1。ROC曲線下面積（AUC）為0.613，與完全隨機獲得的面積0.50間差異有統計學意義（P＜0.05），95%CI為0.514～0.712。SERPING1早期預測LADA的最佳臨界值為289.71 mg/L，靈敏度69%，特異度48%。

Figure 1 ROC curves of SERPING1圖1SERPING1的ROC曲線

3 討論

LADA的早期診斷一直是臨床上比較困難的問題，目前自身抗體檢測陽性是其最直接的依據。但是自身抗體的種類很多，若一一進行篩查成本太高；此外，自身抗體的產生需要一定的時間（特別是IgG抗體）；而且隨著病程的延長，有的抗體會逐漸減弱[7]；再加上許多尚未被醫學界發現和識別的自身抗體，可能導致結果出現假陰性；這些都不利于LADA的早期診斷。

SERPING1本質上是一種105 ku的分泌蛋白。它既是絲氨酸蛋白酶抑制劑，能高效地抑制糜蛋白酶和激肽釋放酶，也是體內主要的抗炎蛋白[8]。它能通過和C1r或者C1s蛋白酶結合形成低活性的化合物而控制C1復合體的激活[9]，可能在調節一些重要的生理學路徑方面扮演重要的角色。這些路徑包括補體激活、血液凝固、纖維蛋白溶解和產生激肽等。SERPING1主要參與如下的生理功能：血液循環、血液凝固的內源性途徑、補體激活的經典途徑、纖維蛋白溶解、先天免疫應答[10]、補體激活和外源性凝集素的負調控、血小板的激活和脫顆粒。有研究顯示某些與炎癥和微血管相關的基因在糖尿病幼鼠模型中是上調的，其中就包括SERPING1[11]。Zhang等[6]運用LC-MS蛋白組學策略對經典T1DM、T2DM和正常人進行對照研究，發現在經典T1DM中血清蛋白組學表現出系統性的先天免疫調節異常，并發現SERP?ING1是區分經典T1DM和T2DM的指標，它在經典T1DM中是上調的。

本研究顯示，LADA組血漿SERPING1高于T2DM組和正常對照組。由于LADA與T1DM有著相似的發病機制，所以可以認為本研究結果與上述研究結果有一致性。進一步通過相關分析及多元逐步回歸分析發現，SERPING1與FCP呈負相關，FCP是血漿SERPING1的主要影響因素。而FCP又是體現胰島功能是否損害的指標，這就表明SERPING1對早期預測LADA有提示作用，故可采用ROC曲線評價SERPING1值對早期LADA患者的檢出效能。ROC曲線是國際公認的評價診斷效能的客觀指標，而0.5＜AUC≤0.7表示診斷價值一般。本研究通過ROC曲線分析證明，SERPING1預測LADA的曲線下面積恰在此范圍內，所以單獨依靠SERPING1早期預測LADA的精準性存在一定缺陷，而SERPING1聯合其他指標檢測將大大提高其診斷效能。雖然ROC曲線表明SERPING1對LADA的早期預測價值一般，但是通過各組間SERPING1的比較、SERPING1與LADA組中其他資料及指標的相關分析，均提示其與LADA關系密切，SERPING1可能參與到LADA的早期發病過程。目前有研究證實[8,11]，由于SERP?ING1是連接及補體系統中主要的蛋白酶抑制劑，因此它也是一種有效的抗炎蛋白，并可能成為一種針對多種炎癥性疾病（包括自身炎癥性疾病）的治療蛋白；而這些炎癥性疾病中已被研究證實的有敗血癥、心肌梗死、遺傳性血管性水腫等[12-13]。LADA也是與炎癥反應密切相關的一種自身免疫性疾病，能否以SERPING1參與LADA的發病機制為切入點，探索治療LADA的新途徑是今后研究的一個思路。

本研究存在一定的局限性：首先，本研究的樣本量稍小，缺乏多中心研究。其次，由于在已知的LA?DA自身免疫性抗體中，GADA在患者中的陽性率較高，所以本研究只收集了GADA陽性的LADA患者的血漿標本，今后將加入其他自身免疫性抗體陽性的LADA標本、進一步擴大樣本量進行多中心的深入研究。總之，基于以上的研究背景與臨床研究結果，可以初步認為雖然SERPING1可在一定程度上預測LADA的發生，但仍需綜合臨床和其他實驗室檢查才能作出準確判斷；SERPING1對LADA的發病機制和治療有一定的提示作用，不過還有待更深入的研究確認。

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