魷魚肝臟活性肽的制備及生物活性研究

朱 瑤，胡建恩，楊 杰，盧 航，劉鵬宇，趙 慧

(大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連116023)

近年來，我國魷魚漁獲量占總漁獲量的比重呈不斷上升的趨勢。在加工過程中產生大量副產物，這部分肝臟大都用于加工魚粉、魷魚漿等初級產品或直接丟棄，這不僅造成資源浪費還對環境造成污染。魷魚肝臟約占魷魚濕重的15%左右，其中約含19%的蛋白質［1］。目前對于魷魚肝臟的研究主要集中在脂肪和蛋白質方面，其中蛋白質主要是制備醬油等調味品和酶制劑［2-3］，對于活性肽的研究報道較為少見。筆者以魷魚肝臟蛋白為原料，通過酶解技術制備生物活性肽，并對其生物活性進行研究，以期為生物活性肽的制備提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑。魷魚內臟購于遼寧大連海洋漁業總公司;木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，購于天津諾奧科技發展有限公司;胃蛋白酶，購于上海蓮冠生物化學有限公司;α-葡萄糖苷酶、對硝基苯麥芽戊糖(pNPG)，購于Sigma公司;TT試劑、PT試劑、APTT試劑，購于上海太陽生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備。Multiskan Ascent酶標儀，購于鞏義市予華儀器有限責任公司;凝血儀為德國TECO產品;高效液相色譜為大連依利特科學儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 肝臟基本營養成分的測定。將-18℃冷凍的魷魚內臟，于室溫解凍，分離魷魚肝臟洗凈后對其基本營養成分(水分、脂肪、蛋白質含量、灰分)進行測定。

1.2.2 魷魚肝臟蛋白質的制備及溶解度的測定。取魷魚肝臟與蒸餾水按1∶1.5(m/v)的比例搗碎制備魷魚肝臟勻漿液，于126℃ 、0.5 MPa條件下蒸煮20 min。將蒸煮液于5 000×g離心20 min，共得到4層物質。其中，最上層為油脂層，其余為蛋白質層，由上至下依次為樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。將得到的蛋白質烘干后粉碎，然后用丙酮進行少量多次脫脂處理，直至丙酮提取液顏色較淺為止。

稱取樣品 1 mg，分別溶于 10 ml pH 分別為 2、4、6、8、10和12的緩沖溶液中，充分混勻后取此濃度蛋白質溶液1 ml，采用Lowry法［4］測定樣品中蛋白質含量，從而測定各蛋白質樣品在不同pH條件下的溶解度，其計算公式為:蛋白質的溶解度=溶液中蛋白質的濃度×溶液總體積/樣品的質量×100%。

1.3 魷魚肝臟生物活性肽的制備 選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶分別對魷魚肝臟蛋白進行酶解，酶解條件如表1所示。

表1 6種酶對魷魚肝臟蛋白的酶解條件

1.4 魷魚肝臟蛋白酶解液水解度的測定 采用甲醛電位滴定法測定溶液中游離氨基酸的數量，計算魷魚肝臟蛋白酶解液的水解度(DH)［5］。

1.4.1 完全水解液的制備。取魷魚肝臟蛋白139.94 mg(100 mg蛋白質)，放入反應瓶中加入6 mol/L的濃鹽酸100 ml。將其密封后放入115℃的烘箱中消化24 h，水解完全后將水解液進行真空濃縮至0.5 ml。取一定量蒸餾水將其洗入燒杯中，用濃度為1 mol/L的NaOH溶液中和至中性(pH為6)，于100 ml容量瓶中定容至刻度線。

1.4.2 酶解液水解度的測定。取滅酶后的水解液8.0 ml，置于容量150 ml的三角瓶中，加入60 ml去CO2蒸餾水，調節pH至8.2。向燒瓶中加入10.0 ml中性甲醛溶液，混勻。用0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定至pH 9.2，記錄此時消耗標準NaOH溶液的體積V1。以相同濃度未水解的魷魚肝臟蛋白溶液為空白，記錄此時消耗標準NaOH溶液的體積V2。計算每克原料蛋白水解得到的游離氨基的毫摩爾數。

同樣取完全水解液8.0 ml，利用甲醛電位滴定法重復以上操作。以相同濃度未水解的蛋白質溶液作為空白對照，分別記錄二者消耗標準NaOH溶液的體積V3和V4，計算每克原料蛋白完全水解得到的游離氨基的毫摩爾數。

按照下式計算魷魚肝臟蛋白各酶解液的水解度:

1.5 魷魚肝臟蛋白酶解液生物活性的測定

1.5.1 抗凝血活性的測定。兔靜脈采血后，立即將其與0.109 mol/ml檸檬酸鈉抗凝劑按體積比9∶1于離心管中混勻，以2 000 g離心15 min，收集上清血漿，置于-70℃冰箱中保存，備用。

待測血漿中 V樣品:V血漿為 1∶9，空白對照中 V生理鹽水∶V血漿為1∶9。

1.5.1.1 凝血酶原時間(PT)的測定。在檢測血漿中加入足量的凝血活酶和鈣離子，測定血漿凝固所需的時間即為血漿凝血酶原時間(PT)。取25 μl待測血漿于37℃預熱1 min后，加入50 μl預熱的PT試劑(5 min≤預熱時間≤15 min)，記錄凝固時間即為PT值。以生理鹽水作為空白對照，每個樣品測定3組平行。

1.5.1.2 凝血酶時間(TT)的測定。待測血漿中加入“標準化”的凝血酶溶液后，血漿凝固所需要的時間為凝血酶時間(TT)。取50 μl待測血漿于37℃預熱1 min，然后加入50 μl預熱的TT試劑(5 min≤預熱時間≤15 min)，記錄凝固時間即為TT值。以生理鹽水作為空白對照，每個樣品測定3組平行。

1.5.1.3 活化部分凝血活酶時間(APTT)的測定。在37℃條件下用白陶土(激活劑)激活Ⅺ、Ⅻ因子。用腦磷脂(部分凝血活酶)代替血小板第3因子，測定乏血小板血漿加入Ca2+離子后凝固所需的時間即為APTT。該試驗是內源性凝血系統靈敏和常用的篩檢試驗。取25 μl待測血漿和25 μl APTT試劑混合，37℃預熱 5 min，然后加入 25 μl 0.025 mol/ml預熱的CaCl2溶液。記錄凝固時間即為APTT值，以生理鹽水作為空白對照。每個樣品測定3組平行。

1.5.2 ACE抑制活性的測定。取5 μl樣品與15 μl ACE混合后于37℃條件下預熱5 min，加入25 μl 7.6 mmol/L的底物 HHL(底物溶解于608 mmol/L NaCl，pH 8.3、0.1 mol/L 硼酸緩沖液)中啟動反應體系，37℃水浴條件下反應25 min，再加入10 μl的10%三氟乙酸終止反應后，用反相高效液相色譜法在波長228 nm條件下測定馬尿酸的含量，以未加樣品為空白對照，按照以下公式計算ACE活性抑制率:

1.5.3 抗氧化能力的測定。

1.5.3.1 還原力測定。根據Dike Teng等［6］測定還原力的方法稍作修改，對樣品的還原力進行測定。取1 ml樣品與1 ml 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液混勻，然后加入1 ml 0.1%的鐵氰化鉀，在50℃條件下反應20 min后，急速冷卻，以1 ml 10%的TFA終止反應。取2 ml此反應液加入2 ml蒸餾水及0.8 ml 0.1%FeCl3混勻，10 min后測定混合液在波長700 nm處吸光值。以1 ml蒸餾水為空白對照，以90 μg/ml VC為陽性對照，按照以下公式計算羥自由基清除率:

1.5.3.2 羥自由基清除能力的測定。參照Fenton反應方法建立反應體系模型［7］。取1 ml 9 mmol/L FeSO4溶液、1 ml 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及1 ml 5 mg/ml樣品溶液于試管中混勻，再加入0.8 ml 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，將混合液于37℃反應30 min。以蒸餾水代替樣品為空白對照，以蒸餾水代替H2O2為背景影響，同時以蒸餾水作為參比，測定反應液在波長510 nm處的吸光值，以250 μg/ml VC作為陽性對照，按照以下公式計算羥自由基清除率:

羥自由基清除率(%)=1-(AS-A0)/Ac×100%

式中，AS為樣品反應吸光值，A0為樣品背景吸光值，Ac為空白對照吸光值。

2 結果與分析

2.1 魷魚肝臟基本營養成分的測定結果 采用國標對魷魚肝臟基本營養成分進行了測定。由表2可知，魷魚肝臟中蛋白質占濕重的17.42%，占干重的33.74%。脂肪占濕重的32.56%，占干重63.06%。

表2 魷魚肝臟基本營養成分的測定結果

2.2 魷魚肝臟蛋白質溶解度 魷魚肝臟經高溫蒸煮離心后得到4層物質，自上而下依次為油脂、懸浮層、溶液層、沉淀層。將3個蛋白質樣品分別于烘箱中烘干后，加入丙酮進行脫脂處理。將脫脂后的3個蛋白質樣品分別溶解于pH為2、4、6、8、10 和12 溶液中，并測定溶解度。試驗發現，溶液層樣品在各pH條件下的溶解度均高于其他樣品，在pH為10條件下溶解度最大，因此選用溶液層蛋白質為原料制備生物活性肽。

2.3 魷魚肝臟蛋白6種酶解液的水解度 采用甲醛定位法測定了6種蛋白酶解液的水解度。從圖1可以看出，中性蛋白酶酶解液最大水解度為13%。

圖1 6種蛋白酶解液的水解度

2.4 魷魚肝臟蛋白酶解液生物活性

2.4.1 抗凝血活性。分別測定了6種酶解液的抗凝血活性。結果表明，中性蛋白酶解液對凝血過程中的內源途徑和共同途徑作用最強，APTT值為59.8 s，TT值為34.2 s，較空白對照分別延長26.7和20.6 s。對于外源凝血途徑(PT值)，各酶解液的作用均不明顯。陽性對照肝素鈉的各值均超過了凝血儀的測定范圍(0～300 s)。

2.4.2 ACE抑制活性。魷魚肝臟經6種蛋白酶水解后，對ACE均有較強的抑制活性，其中中性蛋白酶解液和堿性蛋白酶解液的抑制率較高，分別為68.0%和63.4%。

2.4.3 抗氧化活性。分別測定了6種酶解液的抗氧化活性。結果表明，酸性蛋白酶和胃蛋白酶的水解液還原力最強，其OD700與VC(1.04)相當，分別為0.96和1.00。酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的羥自由基清除能力較好，分別為91.4%、92.2%和93.6%。且高于陽性對照VC(71.1%)。

3 討論

我國海洋生物種類多、資源豐富，在其生長和代謝過程中生產各種具有特殊生理功能的活性物質，為開發研究活性化合物奠定基礎。

該試驗以魷魚肝臟為原料，通過酶解技術制備生物活性肽并測定其活性，得到6種酶解液中中性蛋白酶解液的抗凝血活性和ACE抑制活性最強;堿性蛋白酶也具有較強的ACE抑制活性;酸性蛋白酶和胃蛋白酶均具有較強的抗氧化活性。筆者從魷魚肝臟中制備生物活性肽并對其活性進行初步研究，為今后進一步分離純化及活性研究提供理論基礎，以期提高魷魚肝臟的綜合利用效率。

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［2］袁亞輝，姚美君.利用魷魚內臟生產海味素的研究［J］.漁業現代化，2002(1):28-29.

［3］郭無暇，胡建恩，王秀武，等.魷魚副產物的綜合利用［J］.精細與專業化學品，2006，14(18):6-8.

［4］楊安鋼.生物化學與分子生物學實驗技術［M］.北京:高等教育出版社，2001:248-252.

［5］新淮，馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定［J］.食品科學，1994(11):65-67.

［6］TENG D K，FANG Y，SONG X Y，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis parameters for antioxidant capacity of peptide form goat placenta［J］.Food and Bioproducts Processing，2010，159:1-7.

［7］丁利君，周圳輝，林燕如.芒萁中黃銅物質的提取及抗氧化研究［J］.食品科技，2005，26(8):77-79.