陳雅琳，唐 瑛，王慶敏，孫 歡，周 茜

半夏系天南星科植物半夏屬(Pinelliɑ Ternɑte(Thunb)Breit)的干燥塊莖，是一種常見中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結之功效。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，半夏總 生 物 堿(total alkaloids from Pinelliɑ Ternɑte，TATP)作為半夏的主要有效成分之一，具有抗多種惡性腫瘤的作用，如肝癌、乳腺癌、肺癌等［1-3］。然而，尚未見有關TATP對胃癌的抑制作用的報道，本實驗旨在初步探討TATP對人胃癌細胞株SGC-7901增殖的抑制作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)藥品:TATP購自武漢銀河化工有限公司，純度87%，批號:20110321。用重蒸水配制儲備液10 g/L，4℃保存?zhèn)溆谩嶒灂r，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。(2)細胞株:SGC-7901人胃癌細胞株，本室長期培養(yǎng)。(3)試劑與儀器:DMEM培養(yǎng)基(高糖)、胎牛血清、青鏈霉素均購自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶購自上海實生細胞生物技術有限公司;四甲基偶氮唑鹽購自Amresco公司;二甲基亞砜分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;染料碘化丙啶購自Sigma公司。酶標儀(Thermo Scientific Multiskan MK3，芬蘭)，熒光顯微鏡(Olympus BX-51，日本)，倒置顯微鏡(Olympus CKX41SF，日本)。

1.2 方法 (1)細胞培養(yǎng):SGC-7901胃癌細胞株用含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素、含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細胞實驗。(2)實驗方法:MTT法檢測試驗、TATP對SGC-7901細胞形狀影響、單細胞凝膠電泳技術參考文獻［4］。(3)分組:TATP組為SGC-7901胃癌細胞株(6例)，本實驗室長期培養(yǎng)。對照組與正常人胃細胞株(6例)。

2 結果

2.1 TATP對細胞增殖的影響 TATP組各濃度和各藥物處理時間與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。不同濃度的TATP能有效抑制 SGC-7901細胞增殖，且隨著TATP濃度的增加和藥物處理時間的延長，其抑制作用亦明顯增強，并在一定的濃度與時間范圍內(nèi)表現(xiàn)出時效與量效關系。經(jīng)計算TATP作用于人胃癌細胞24、48、72 h的 IC50分別為46.28、27.23、13.43 mg/L。

2.2 細胞形態(tài) 人胃癌細胞SGC-7901為上皮樣細胞，貼壁伸展、緊密生長。顯微鏡下觀察對照組細胞胞體大而飽滿，呈鋪路石狀，折射率高，增殖旺盛;經(jīng)TATP處理后細胞數(shù)減少，細胞胞體皺縮為圓形，折射率變?nèi)酰g距變大，貼壁能力減弱，隨著TAPT濃度的增加，細胞脫落漂浮于培養(yǎng)基的現(xiàn)象越明顯，且有少部分細胞出現(xiàn)腫大壞死現(xiàn)象。

2.3 TATP對細胞集落形成的影響 由表2可知，與對照組比較，各劑量組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。不同濃度的TATP對SGC-7901細胞集落的形成均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，集落形成率和相對增殖存活率明顯下降。對照組SGC-7901細胞，集落多且大;濃度為10 mg/L的實驗組細胞加藥后有變圓趨勢，生長緩慢，4 d后細胞開始分裂增殖，形成的集落較對照組小且松散;濃度為20 mg/L的實驗組加藥后細胞變圓且1周內(nèi)未出現(xiàn)分裂增殖，形成的集落數(shù)目少且形狀不規(guī)則;濃度為40 mg/L的實驗組加藥后細胞變圓且有脫落現(xiàn)象，形成集落很少，見表2，圖1。

表2 不同濃度TATP對SGC-7901細胞集落形成的影響(±s，每組n=6)

表2 不同濃度TATP對SGC-7901細胞集落形成的影響(±s，每組n=6)

注:TATP:半夏總生物堿。與對照組比較aP＜0.01

組別 濃度(mg/L)集落形成數(shù)集落形成率(%)相對增殖存活率(%)對照組 0 154.67±11.56 30.93—TATP組 10 103.17±8.06 20.63a 66.70 20 48.64±6.54 9.73a 31.46 40 25.33±4.12 5.06a 16.36

表1 不同濃度TATP對SGC-7901細胞增殖的影響(±s，每組n=6)

表1 不同濃度TATP對SGC-7901細胞增殖的影響(±s，每組n=6)

注:TATP:半夏總生物堿。與對照組比較aP＜0.05，bP＜0.01

增殖情況(A值)抑制率(%)24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對照組 0 0.525±0.033a 0.905±0.019a 1.337±0.025a — —組別 濃度(mg/L)—TATP組 2.5 0.513±0.023a 0.798±0.028b 1.069±0.018b 0.024 0.119 0.200 5 0.467±0.030b 0.766±0.022b 1.055±0.021b 0.112 0.154 0.211 10 0.444±0.031b 0.643±0.029b 0.767±0.022b 0.155 0.290 0.426 20 0.379±0.025b 0.485±0.023b 0.456±0.025b 0.279 0.464 0.659 30 0.348±0.024b 0.397±0.019b 0.260±0.018b 0.338 0.562 0.805 40 0.291±0.023b 0.299±0.021b 0.190±0.027b 0.445 0.669 0.858 50 0.247±0.019b 0.265±0.025b 0.147±0.030b 0.531 0.7070.890

圖1 不同濃度的TATP對人胃癌SGC-7901細胞集落形成的影響(Giemsa染色×100)

2.4 TATP對細胞DNA的損傷作用 不同濃度TATP對SGC-7901細胞DNA均有不同程度的損傷，且隨著濃度的增加，細胞拖尾越來越嚴重，頭部有越來越小的趨勢(圖2)。用CASP彗星分析軟件進行分析，結果列于表3。與對照組相比，各劑量組間尾DNA含量、尾長及尾動量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖2 不同濃度的TATP造成的SGC-7901細胞拖尾情況

表3 不同濃度TATP作用24 h SGC-7901細胞拖尾變化(μm，±s，每組n=6)

表3 不同濃度TATP作用24 h SGC-7901細胞拖尾變化(μm，±s，每組n=6)

注:TATP:半夏總生物堿。與對照組比較aP＜0.01，bP＜0.05

(mg/L)對照組0 7.83±3.45 10.06±5.17 0.88±0.23 TATP組 10 16.30±4.29b39.29±9.46b 5.37±3.64b 20 24.57±5.41a 55.18±14.21a15.21±7.39a 40 37.58±7.77a70.45±19.99a24.83±9.67a含量 尾長 尾動量組別 濃度 尾DNA

3 討論

胃癌是最常見的腫瘤之一，在非洲、歐洲和亞洲地區(qū)發(fā)病率較高，胃癌發(fā)病率位居第四，死亡率位居第三。胃癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中居首位，其死亡率位居第二位［5-6］。目前從天然藥物中篩選有效的活性物質已成為中國醫(yī)學界的研究熱點。大量實驗研究表明，中醫(yī)藥能多環(huán)節(jié)、多靶位抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉移，其主要作用機制有誘導細胞凋亡、抑制DNA合成、阻滯信號傳導、抑制血管生成、控制端粒及端粒酶的穩(wěn)定性、細胞毒作用、放化療保護、逆轉多藥耐藥以及抑制癌基因的表達等［6］。TATP是傳統(tǒng)中藥半夏的主要活性成分之一，孫歡等［2］研究發(fā)現(xiàn)TATP對人乳腺癌細胞MDA-MB-435S增殖有明顯的抑制作用。周茜等［3］研究發(fā)現(xiàn)TATP對人肺癌細胞A549的增殖抑制作用與加藥濃度、時間呈正相關。陳芳等［1］研究發(fā)現(xiàn)隨著TATP濃度的增加和加藥時間的延長，其對人肝癌細胞Bel-7402的生長抑制作用也逐漸增強。本實驗研究發(fā)現(xiàn)TATP能抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖，降低集落形成率，并具有損傷癌細胞DNA作用。

腫瘤細胞具有無限制的自我更新能力，這與其增殖、侵襲及轉移密切相關，抗腫瘤藥物的干涉能影響細胞的這種能力。因此筆者檢測了10、20、40 mg/L TATP對SGC-7901細胞集落形成的影響，發(fā)現(xiàn)TATP對胃癌細胞集落的形成亦有抑制作用，且隨著濃度的增加，集落形成率和相對增殖存活率明顯下降，進一步驗證了 TATP對人胃癌細胞增殖具有抑制作用。

中藥作用于癌細胞生長的各個階段，導致細胞生長所需要的DNA、RNA、蛋白質斷裂變性或合成受到嚴重破壞，從而使其停止于生長周期中的某一環(huán)節(jié)或導致死亡。單細胞凝膠電泳是一種高靈敏度的DNA斷裂檢測技術，廣泛應用于細胞DNA損傷與修復、環(huán)境監(jiān)測、遺傳毒理、氧化應激以及細胞凋亡等研究中［7-8］。本實驗研究結果表明，經(jīng)10、20、40 mg/L的TATP處理24 h后，與對照組相比，TATP組細胞的尾DNA含量、尾長以及尾動量均有極顯著差異，且隨著藥物濃度的增加，DNA損傷亦嚴重。

綜上，TATP對人胃癌細胞SGC-7901具有明顯的增殖抑制作用，且與藥物濃度、加藥時間呈正相關。其抑制作用可能通過誘導癌細胞的DNA損傷，阻止細胞分裂，誘導細胞凋亡，從而達到抑制癌細胞增殖。

［1］陳芳，唐瑛，文曄，等.半夏生物堿對人肝癌細胞Bel-7402的生長抑制作用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2010，20(10):83-84.

［2］孫歡，唐瑛，周茜，等.半夏總生物堿對人乳腺癌細胞增殖的抑制作用［J］.華南國防醫(yī)學雜志，2012，26(5):9-12.

［3］周茜，唐瑛，孫歡，等.半夏總生物堿對人肺癌細胞增殖的抑制作用［J］.藥學實踐雜志，2013，31(1):38-41.

［4］Singh NP.Microgels for estimation of DNA strand breaks，DNA protein crosslinks and apoptosis［J］.Mutat Res，2000，455(1-2):111-127.

［5］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin 2011，61(2)，69-90.

［6］李鑫，衛(wèi)蓉.中醫(yī)中藥治療胃癌的研究進展［J］.貴陽中醫(yī)學院學報，2012，34(1):116-119.

［7］Ross GM，McMillan TJ，Wilcox P，et al.The single cell microgel electrophoresis assay(comet assay):technical aspects and applications:Report on the 5th LH Gray Trust Workshop，Institute of Cancer Research，1994［J］.Mutat Res，1995，337(1):57-60.

［8］Collins AR.Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay［J］.Biochim Biophys Acta，2013，22(13):1-7.

(本文編輯:王映紅)