雙重PCR熔解曲線峰快速檢測(cè)食品中豬源性成分方法的建立

高 菲，蒲紅州，沈林園，蔣小兵，雷懷剛，沈 靜，李學(xué)偉，朱 礪，*（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安6504；.四川省馬邊金涼山農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，四川馬邊64600）

雙重PCR熔解曲線峰快速檢測(cè)食品中豬源性成分方法的建立

高 菲1，蒲紅州1，沈林園1，蔣小兵1，雷懷剛1，沈 靜2，李學(xué)偉1，朱 礪1，*
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安625014；2.四川省馬邊金涼山農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，四川馬邊614600）

基于國(guó)際生命條碼聯(lián)盟（CBOL，the Consortium for the Barcode of Life）提出的barcoding技術(shù)所確定的序列區(qū)域，針對(duì)豬的線粒體COⅠ基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。為了避免食品中PCR抑制劑的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置GCG（胰島素受體）基因125bp的純化片段為內(nèi)參照，控制假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，豬和GCG基因的特異性產(chǎn)物在79.2℃和75℃有特異性熔解峰。設(shè)置牛、羊、雞、兔、鼠和空白對(duì)照，均無(wú)擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果表明，該豬特異性引物的PCR產(chǎn)物含有245bp的核苷酸序列與GenBank中相應(yīng)序列吻合；該方法檢出限為0.001%。

雙重?zé)晒釶CR，DNA條形碼，豬源性成分，細(xì)胞色素C氧化酶基因Ⅰ，內(nèi)參照

肉類(lèi)食品作為人類(lèi)膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因價(jià)格差異、風(fēng)俗習(xí)慣、疾病傳播等方面的原因，造成了食品摻假、檢驗(yàn)防疫、宗教信仰等問(wèn)題的出現(xiàn)。比如，用相對(duì)便宜的豬肉摻假牛、羊肉；豬肉被用在回族和伊斯蘭教人的食品中；疫情的傳播等。特別是將豬肉非法加工冒充牛、羊等其他肉類(lèi)的行為，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的利益。所以建立有效檢測(cè)豬源性成分的方法顯得特別重要[1-3]。

目前，主要的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法以分子生物學(xué)為主[4]。在國(guó)外，已經(jīng)出現(xiàn)了常見(jiàn)物種的檢測(cè)試劑盒。但是試劑盒的靈敏度較低，且對(duì)樣品的質(zhì)量要求較高[5]。為了探究更為快速、靈敏的方法，本研究采用雙重SYBR GreenⅠReal-Time PCR技術(shù)。該技術(shù)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物累積信號(hào)，得出準(zhǔn)確的結(jié)果。這樣減少了以往電泳時(shí)繁瑣步驟的干擾，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和靈敏。引入單拷貝基因GCG為內(nèi)參照基因，用來(lái)監(jiān)控抑制劑對(duì)PCR反應(yīng)的影響，避免了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。選擇DNA條形碼特定區(qū)域序列作為目的片段來(lái)檢測(cè)豬源性成分，為國(guó)際DNA條形碼計(jì)劃在分類(lèi)學(xué)上的應(yīng)用，提供了佐證[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬、牛、羊、雞、兔、鼠等肌肉樣品 采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)；Takara DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products Kit、SYBR?Prime Script TMRT-PCR Kit購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA MarkerⅡ、蛋白酶K等 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；chelex-100 購(gòu)自成都博奧維新生物科技有限公司；COⅠ基因序列的上游引物P1：CTATCCCAGG ACGACTAAA，下游引物P2：TTGTGGCATACCATT GAG；GCG單拷貝基因序列的上游序列P3：GCAAC TGCTCCTTACCAATGAAA，下游引物P4：CAGAATG TCAGGCG-RTTCAGATAT 深圳華大基因科技有限公司。

Smart Spec TMPlus分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)、iQTM5 Multicolor Real-TimePCR 美國(guó)BIO-RAD公司；離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)DNA條形碼技術(shù)的規(guī)定，用Primer Premier 5.0和Oilgo 6.0軟件，根據(jù)GenBank中豬的線粒體COⅠ基因序列設(shè)計(jì)引物；內(nèi)參照基因采用豬GCG（胰島素受體）單拷貝基因純化片段，并設(shè)計(jì)引物，使兩對(duì)引物的退火溫度在60℃左右。

1.2.2 DNA抽提 取出凍存在-80℃冰箱環(huán)境下的新鮮樣品，用研缽在液氮環(huán)境下碾碎，然后采用Chelex-100法抽提總DNA[9]。最后總DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙重PCR反應(yīng)體系的建立 通過(guò)溫度梯度PCR方法，分別探索豬引物GCG基因引物的退火溫度。在確定退火溫度以后，探索雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：該反應(yīng)總體系為20滋L，其中SYBR GreenⅠPreMix設(shè)置10、11、12、13滋L四個(gè)梯度，上下游引物（10滋mol/L）各1滋L，DNA模板（50ng/滋L）各1滋L，用DEPC水補(bǔ)至20滋L。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，2min；95℃，30s；57℃，30s；72℃，1min，進(jìn)行35次循環(huán)。在此前的反應(yīng)基礎(chǔ)上，優(yōu)化PCR體系中各物質(zhì)的最佳濃度。其中豬COⅠ基因引物和內(nèi)參基因引物的比例采用1滋L∶0.8滋L、1滋L∶0.9滋L、1滋L∶1滋L用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；豬COⅠ基因模板和內(nèi)參基因模板DNA的采用2滋L∶2滋L、2滋L∶1.5滋L、2滋L∶1滋L、2滋L∶0.5滋L用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物和模板采用一一配對(duì)的方式，總共16次組合，都采用同一退火溫度進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

1.2.4 特異性檢測(cè) 分別選取牛、羊、雞、兔、鼠樣品的DNA為模板與豬肉樣品的陽(yáng)性對(duì)照；用DEPC水代替DNA模板做陰性對(duì)照；并加入GCG基因片段和引物P3、P4作為內(nèi)參照，檢測(cè)模板中是否含有PCR抑制劑。

1.2.5 靈敏度檢測(cè) 將豬DNA模板樣品稀釋至0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%的含量。取各濃度DNA 2滋L，并加入GCG基因片段DNA 1滋L共同作為模板，進(jìn)行PCR靈敏度檢測(cè)。

1.2.6 樣品檢測(cè) 將牛、羊、雞、兔、鼠樣品的DNA做為模板進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的可靠性。

1.2.7 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定 將PCR產(chǎn)物純化后送深圳華大科技有限公司測(cè)序，檢驗(yàn)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化

通過(guò)溫度梯度PCR的結(jié)果，顯示兩個(gè)單重反應(yīng)的最適退火溫度為60℃。經(jīng)過(guò)對(duì)1.2.2的排列組合優(yōu)化篩選，2種引物的用量為1滋L∶0.8滋L；豬COⅠ基因模板和內(nèi)參照基因模板的用量分別為2滋L和1.5滋L。優(yōu)化后結(jié)果如圖1所示。能在不同溫度點(diǎn)形成清晰可見(jiàn)的峰圖，峰的熒光值都達(dá)到了4000以上，每個(gè)樣品中IPC都能在75℃時(shí)形成特異性的熔解曲線峰，豬源性成分的特異性熔解曲線在79.2℃形成。

圖1 豬源性成分特異性熔解曲線圖Fig.1 Porcine endogenous component-specific melting curves

2.2 方法特異性檢驗(yàn)

將雞、狗、羊、兔、鼠樣品的DNA和豬樣品的DNA按1∶1混合，做為擴(kuò)增模板，用于檢驗(yàn)該方法的特異性。結(jié)果表明（見(jiàn)圖2），常見(jiàn)動(dòng)物樣本DNA為模板和空白對(duì)照組都未在79.2℃形成特異性熔解峰（Ct＞35）。該結(jié)果表明，該方法特異性良好，且所有模板中不含有PCR抑制劑成分。

圖2 混合DNA中豬特異性熔解曲線Fig.2 Swine specific melting curve of mixed DNA template

2.3 方法靈敏度檢驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步將豬DNA模板稀釋至含量為1%、0.01%、0.001%、0.0001%后再進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)。結(jié)果表明（見(jiàn)圖3），在PCR過(guò)程中只有0.0001%濃度沒(méi)有生產(chǎn)有效的熔解曲線峰。表明此SYBR GreenⅠRealtime-PCR熔解曲線法的檢出限為0.001%。

圖3 靈敏度檢測(cè)Fig.3 Sensitivity Detection

2.4 研究方法的驗(yàn)證與應(yīng)用

在餐廳里買(mǎi)回兩份牛、羊肉樣品，在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)了雞、兔、牛、羊肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，用于驗(yàn)證本方法。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，燒烤餐廳的牛、羊肉有豬肉摻假。可能是因?yàn)樨i肉比牛、羊肉便宜，且外觀上不容易分辨它們的差別。

圖4 實(shí)例檢測(cè)中豬源性特異性熔解曲線圖Fig.4 Porcine endogenous specific melting curves of examples of detection

2.5 測(cè)序驗(yàn)證

特異性擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank相應(yīng)序列的比對(duì)結(jié)果表明，該片段全長(zhǎng)245bp，位于豬線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（CO I）序列的3’端，該短序列具有相對(duì)適中的保守性，適合用于種屬鑒別。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采集了商業(yè)肉制品進(jìn)行驗(yàn)證，顯示該方法實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)代分子診斷技術(shù)快速、準(zhǔn)確、大批量和經(jīng)濟(jì)的要求。本實(shí)驗(yàn)使用了chelex-100法和商業(yè)DNA抽提試劑盒，提取樣品中的總DNA，能滿足濃度0.0001%含量的檢測(cè)要求。與傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測(cè)方法比較，該方法不需要使用瓊脂糖凝膠、核酸染料等有害物質(zhì)，從而避免了污染環(huán)境。

雙重PCR溶解曲線峰快速檢測(cè)法最重要的兩個(gè)部分就是引物設(shè)計(jì)和退火溫度的設(shè)定。根據(jù)Arong Luo等[7，10-11]報(bào)道以線粒體DNA做為標(biāo)記基因有以下四個(gè)優(yōu)點(diǎn)：覆蓋物種的數(shù)量多；種間和種內(nèi)的序列差異適中；能夠解決不同分類(lèi)階元的問(wèn)題；基因序列的突變率較低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Vrijenhoek等[12]提出，線粒體基因具有組織中含量大，無(wú)組織特異性，易于獲取等優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面，特異性差的引物，在PCR過(guò)程中產(chǎn)生較多的非特異性擴(kuò)增，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；引物擴(kuò)增的產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，引物的GC含量太高或太低都會(huì)影響該方法的熔解溫度（Tm值）。在減少誤差方面，本實(shí)驗(yàn)采用以擴(kuò)增內(nèi)參照GCG基因片段的方法來(lái)解決，促進(jìn)了多重PCR的應(yīng)用，同時(shí)減少了誤差。在PCR過(guò)程中，GCG基因片段會(huì)與檢測(cè)目的片段競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系中的dNTP。樣品DNA濃度偏低會(huì)導(dǎo)致，熔解曲線峰不明顯，太高可能抑制GCG基因片段的擴(kuò)增。調(diào)節(jié)引物之間的濃度比和DNA濃度比，是該方法的另一關(guān)鍵步驟。

4 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，P1、P2引物在豬源性成分的檢測(cè)中，具有很高的特異性，其檢出限為0.001%，滿足檢測(cè)條件。該方法可以用于食品中豬源性成分的特異性檢測(cè)。

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Establishment of duplex PCR melting curve for rapid identification of swine origins in foodstuff

GAO Fei1，PU Hong-zhou1，SHEN Lin-yuan1，JIANG Xiao-bing1，LEI Huai-gang1，SHEN Jing2，LI Xue-wei1，ZHU Li1，*
（1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Mabian Gold Liangshan Agricultural Development Co.，Ltd.，Mabian 614600，China）

Primers specific to swine was designed for species-specific COⅠgene-amplification from barcoding was proposed by CBOL.Simultaneously in order to prevent false negative results，GCG gene fragment was used for the internal positive control（IPC）.Gene products of swine and GCG were represented in two melting peaks generated simultaneously at temperatures of 79.2℃and 75℃respectively.The specificity of the method was evaluated using template DNAs from bovine，chevon，chicken，rabbit，rat and NTC，whereas only amplification products of GCG gene were obtained.DNA sequencing results showed that the sequence of swine-specific products was 245bp，and which were 100%matching the corresponding sequence in the GenBank.The LOD of this method was 0.001%.

duplex SYBR green real-time PCR；DNA barcoding；swine；COⅠ；IPC

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0081-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.008

2013－01－05 *通訊聯(lián)系人

高菲（1987-），男，在讀研究生，研究方向：豬肉品質(zhì)。

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目（2011NZ0099-1）。