冷水魚腸道抑菌活性乳酸菌的篩選及其生理特性分析

任士菊，王俊鋼，周 紅，鄧 梅，馬 媛，倪永清，*（.石河子大學食品學院，新疆石河子83000；.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆石河子83000）

冷水魚腸道抑菌活性乳酸菌的篩選及其生理特性分析

任士菊1，王俊鋼2，周 紅1，鄧 梅1，馬 媛1，倪永清1，*
（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆石河子832000）

利用牛津杯法對分離自冷水魚腸道的24株乳酸菌進行篩選，得到具有明顯抑菌活性的乳酸菌9株，基于菌株的16S rDNA基因序列進行系統發育分析，6株屬于Lactococcus屬，3株屬于Enterococcus屬。對9株乳酸菌發酵上清液進行抑菌成分分析和蛋白質性質實驗，結果表明，9株乳酸菌的發酵上清液經排除酸和過氧化氫干擾后，對李斯特菌仍具有不同程度的抑制作用；有機酸的產生對實驗菌株MHY3-2和MD-2抑菌活性的干擾影響較大，而菌株MB2-1和MD-1受有機酸干擾影響較小，且經排除酸和過氧化氫后的乳酸菌對李斯特菌的抑菌效果最為顯著；分析發酵上清液中抑菌物質的蛋白質性質，發現除菌株MB2-2和MD-1對胰蛋白酶表現不敏感外，其余實驗菌株發酵上清液經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后均失去抑菌活性，結果表明，實驗菌株的發酵上清液中的抑菌物質具有蛋白質的性質，抑菌組分中可能存在類細菌素或細菌素組分。此外，對9株乳酸菌的抗生素耐藥性進行初步分析，結果顯示，所有實驗菌株對氨芐西林、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、環丙沙星和諾氟沙星均表現敏感，為冷水魚腸道乳酸菌資源的開發利用奠定基礎。

抑菌活性，乳酸菌，篩選，生理特性

大多數乳酸菌作為一般公認的安全的（generally recognized as safe，GRAS）[1-3]微生物，被普遍應用于食品保藏技術中，在一定程度上可以延長食品貨架期，起到一定防腐的作用。乳酸菌在代謝過程中可以產生有機酸、過氧化氫、雙乙酰以及細菌素等抑菌成分物質[4-5]，能有效地抑制食品中一些食源性病原菌或腐敗菌的生長[6-8]。細菌素作為一種安全的、天然的生物型防腐劑[9]取代化學合成的食品添加劑應用到食品工業具有極大的應用潛能[10]。雖然目前已知的細菌素種類繁多，但廣泛應用于食品工業且成功實現商業化生產的僅有乳酸鏈球菌素Nisin[11]。

乳酸菌在自然界中分布廣泛，低溫或極端環境中也發現有乳酸菌的存在，但是該類乳酸菌卻并未得到充分的認識和開發，尤其在國內關于低溫乳酸菌尤其是具有抑菌活性的耐冷乳酸菌的研究和報道為空白。具有很強生長活性和較高比生長速率的產細菌素的適低溫乳酸菌，作為生物保護劑在食品保鮮尤其是低溫冷藏保鮮中具有更大的優勢和極具潛力的應用價值。

我國新疆北部阿勒泰地區地處北緯44°59′35″～49°10′45″之間，境內額爾齊斯河、烏倫古河等流域蘊藏著豐富的冷水魚資源，為研究和開發具有抑菌活性的低溫乳酸菌提供了有利的條件。本研究從新疆冷水魚腸道分離的24株乳球菌（Lacterococcus spp.）、腸球菌（Enterococcus spp.）中篩選具有抑菌活性的乳酸菌菌株，并對抑菌活性乳酸菌發酵上清液的抑菌物質成分及菌株的生理特性進行了初步研究，為冷水魚腸道乳酸菌資源的開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

24株乳酸菌 實驗室保藏菌種，分離自新疆阿勒泰地區額爾齊斯河流域冷水魚腸道；大腸桿菌、李斯特菌 實驗室保藏菌株；金黃色葡萄球菌CICC21600 中國工業微生物菌種保藏管理中心購買；MRS肉湯、M17瓊脂 青島高科園海博生物技術有限責任公司；PCR反應試劑 生工生物工程（上海）有限公司；0.22μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；抗菌藥物紙片 杭州天和微生物試劑有限公司。

5810R高速冷凍離心機 德國eppendorf儀器公司；SPX智能生化培養箱 寧波市江南儀器廠；PHS-3C標準型pH計 上海精密科學儀器有限公司；TC-512PCR擴增儀 英國Techne公司；PowerPac Universal水平電泳儀 美國BioRad公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌無細胞發酵上清液的制備[12-13]分離自冷水魚腸道的24株乳酸菌，按2%的接種量接種于100mL MRS液體培養基中，16℃條件下培養48～72h后，離心（10000×g，10min，4℃）獲得上清液，并用0.22μm微孔濾膜過濾得到無細胞發酵上清液，于4℃條件下保存備用。

1.2.2 具有抑菌活性乳酸菌的初步篩選 選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯法[14]對24株乳酸菌進行抑菌活性的初步篩選。取100μL指示菌菌懸液（濃度約為106～107CFU/mL）均勻涂布于LB平板，向牛津杯中加入200μL發酵上清液，4℃條件下預擴散3～5h，37℃培養18～24h，測定抑菌圈直徑。

1.2.3 乳酸菌發酵上清液中抑菌物質成分分析 選取李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯法對9株乳酸菌發酵上清液進行抑菌成分分析。無細胞發酵上清液通過以下幾種方式進行處理：用1mol/L無菌NaOH調節上清液pH至6.5（圖1B）；先調節上清液pH至6.5，再加入過氧化氫酶（終濃度5mg/L）37℃水浴2h，進行滅酶處理（圖1C）；為進一步確定檢測抑菌物質的蛋白質性質，向上清液中分別加入胰蛋白酶和胃蛋白酶（終濃度1mg/mL）37℃水浴2h，進行滅酶處理（見表2），以不做任何處理的發酵上清液作為對照（圖1A）。吸取200μL上述處理后的發酵上清液加于牛津杯中，4℃冰箱中預擴散3～5h，37℃培養24h，測量抑菌圈直徑，平行測定三次取平均值。

1.2.4 具有抑菌活性乳酸菌的16S rRNA系統發育分析 DNA的提取按照Zeng[15]等的方法進行。采用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）擴增乳酸菌16S rDNA基因。PCR擴增產物通過2%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物送交上海生工生物科技有限公司進行測序。測序結果提交到GenBank數據庫，通過BLAST工具搜索同源性較高的序列，并采用CLUSTAL X 1.81和MEGA 5.0軟件對其進行比對分析并建立系統發育樹。

1.2.5 溫度對乳酸菌生長的影響 具有抑菌活性的乳酸菌菌株以2%接種量接種于10mL的MRS液體培養基中，分別置于4、12、16、24、28、37℃六個溫度條件下進行培養，24h后測定其OD600值。

1.2.6 藥物敏感性測定 采用藥物紙片瓊脂擴散法[16]，測定9種具有抑菌活性的乳酸菌對常見15種抗生素的敏感性。吸取100μL菌懸液（濃度為107～108CFU/mL）均勻涂布于M17[17]固體平板表面，待瓊脂表面干燥后，將抗菌藥物紙片貼于瓊脂表面，每個培養皿等間距放置3張同種藥物的紙片，置于16℃培養箱中恒溫培養24～48h，觀察并測定其抑菌圈直徑。9株乳酸菌藥敏實驗的測定，選用金黃色葡萄球菌ATCC25923標準菌株作為質控菌，實驗結果參照WHO提供的最新版的NCCLS標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性乳酸菌的篩選

采用牛津杯法對分離自冷水魚腸道的24株乳酸菌進行初步篩選，共得到具有明顯抑菌活性的菌株9株。由表1可以看出，9株乳酸菌對李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌3種指示菌均具有較好的抑制作用。

2.2 乳酸菌發酵上清液中抑菌物質成分分析

乳酸菌發酵上清液排除有機酸后，發現9種乳酸菌的發酵上清液對李斯特菌的抑制作用均有不同程度的減弱（見圖1）。這一現象的產生顯然是由于解除了乳酸菌產生的有機酸對指示細菌的抑菌作用[18]。由圖1可以看出，有機酸產生對菌株MHY3-2和MD-2抑菌活性干擾影響最顯著；而菌株MB2-1和MD-1的發酵上清液經排除酸和過氧化氫處理后，對李斯特菌仍具有較好的抑菌效果，排酸實驗對抑菌活性的干擾較小。而對比發酵上清液過氧化氫酶處理前后的實驗結果（圖1）可以看出，過氧化氫對實驗菌株發酵上清液抑菌活性的影響不明顯。

表1 具有抑菌活性乳酸菌的初篩結果（mm）Table 1 Preliminary result of lactic acid bacteria with inhibitory activity（mm）

圖1 無細胞發酵上清液抑菌物質成分分析Fig.1 Antibacterial substance component analysis of cell-free fermentation supernatant

分析發酵上清液中抑菌物質的蛋白質性質，實驗結果（表2）顯示，9株乳酸菌發酵上清液經過胃蛋白酶處理后，均失去抑菌活性；除菌株MB2-2和MD-1經胰蛋白酶處理后抑菌圈直徑未發生明顯變化外，其余菌株產生的抑菌物質對胰蛋白酶均較敏感。上述結果表明，實驗菌株的發酵上清液中的抑菌物質具有蛋白質的性質，抑菌組分中可能存在類細菌素或細菌素組分。

2.3 抑菌活性乳酸菌菌株的系統發育

基于9株乳酸菌16S rRNA部分基因序列，使用Maximum Likelihood構建系統發育樹（圖2），結果顯示，具有抑菌活性的9株乳酸菌菌株分別屬于Lactococcus和Enterococcus屬。由系統發育樹可知，這些菌株隸屬于Lactococcus屬的6株，其中菌株MB2-2，MHY3-4和MB2-3與Lactococcus garvieae親緣關系較近；MD-1與菌株Lactococcuslactis subsp.lactis NFL（KC146069.1）具有99%的序列相似性，MHY3-2與Lactococcuspiscium MARL41（JN226415.1）的序列相似性在99%以上，而MHY3-3在發育樹上與Lactococcusraffinolactis cG08（AB593336.1）的親緣關系最近。菌株MB2-1，MD-2和MD-3隸屬于Enterococcus屬，其中菌株MD-2和MD-3在系統發育樹上與Enterococcus faecalis LRC31（JF772057.1）聚為一簇，具有較近的進化距離；MB2-1與Enterococcushermanniensis SS1760（GQ337028.1）的16S rDNA序列具有98%的同源性。

圖2 基于抑菌活性乳酸菌16SrRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenic tree of lactic acid bacteria with inhibitory activity based on 16S rRNA gene partial sequences

2.4 乳酸菌最適生長溫度范圍的測定

由圖3可以看出，實驗菌株在低于10℃條件下生長相對緩慢，15～20℃的條件下隨著溫度的升高，菌液的OD值呈上升趨勢。結果表明，乳酸菌的優勢生長溫度都在20℃以上，最適生長溫度在24℃左右，生長溫度范圍介于4～37℃，屬于耐冷乳酸菌范疇。

2.5 抗生素耐藥性分析

對9株具有抑菌活性的乳酸菌進行藥敏實驗，結果（表3）顯示，所有實驗菌株對氨芐西林、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、環丙沙星和諾氟沙星均表現敏感，而對頭孢噻肟、克林霉素、卡那霉素和鏈霉素均耐藥。實驗發現，大多數實驗菌株對利福平、復方新諾明、青霉素及四環素表現敏感或中度敏感，而大多數實驗菌株對對慶大霉素表現耐藥。

表2 發酵上清液中抑菌物質的蛋白質性質（mm）Table 2 Proteinaceous nature of fermentation supernatant inhibitory substance（mm）

圖3 溫度對9株抑菌活性乳酸菌生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of 9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity

表3 9株具有抑菌活性的乳酸菌對抗生素的耐藥性Table 3 Antibiotic resistance of 9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity

3 結論

選取李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌，利用牛津杯法對分離自冷水魚腸道的24株乳酸菌進行初步篩選，共篩選出具有明顯抑菌活性的乳酸菌9株，其中6株隸屬于Lactococcus屬，其他3株屬于Enterococcus屬。對9株乳酸菌發酵上清液進行抑菌成分分析和蛋白酶敏感性實驗，結果表明，9株乳酸菌發酵上清液中可能存在細菌素或其他抑菌肽成分，這與G Rajaram等[4]報道的乳酸菌產生具有抑菌活性的蛋白或多肽的結論相一致。

研究發現，菌株MB2-1和MD-1排除酸和過氧化氫處理后的發酵上清液對李斯特菌的抑制效果最為突出，經初步分析，這兩株乳酸菌可能為產細菌素或類細菌素的優良菌株。

采用藥物紙片瓊脂擴散法對分屬于2個屬的9株乳酸菌進行15種抗生素的敏感性測定，結果表明，所有菌株對氨芐西林，萬古霉素，紅霉素，氯霉素，環丙沙星和諾氟沙星均表現敏感，但對于其他抗生素，不同菌株存在不同程度的耐藥性，這可能與菌株是否攜帶耐藥基因及其生物學等特性相關。研究發現，許多腸球菌屬菌株存在gelE，esp，ace，efaA，vanA和vanB等毒力基因[19-21]，鑒于菌株MB2-1，MD-2和MD-3的安全性，后續我們將會對具有抑菌活性的腸球菌屬菌株的毒力基因及其產細菌素的相關特性進行深入研究，為今后將其應用于生物防腐技術及食品保鮮奠定理論基礎。

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Screening of lactic acid bacteria with inhibitory activity isolated from intestinal of cold water fish and analysis of its physiological property

REN Shi-ju1，WANG Jun-gang2，ZHOU Hong1，DENG Mei1，MA Yuan1，NI Yong-qing1，*
（1.College of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Agricultural Product Processing Research Institute，Xinjiang Academy of Agriculture，Shihezi 832000，China）

9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity were screened from 24 lactic acid bacteria isolated from cold water fish intestinal by using oxford cup method.6 strains belonged to Lacterococcus genus and 3 strains belonged to Enterococcus genus by phylogenic analysis based on their partial 16S rDNA gene sequences.Cell-free fermenting supematants（CFSs）from 9 strains were performed to determine the inhibitory compounds and the proteninaceous nature of inhibitors.The result showed that CFSs of 9 lactic acid bacteria still exhibit different degree of inhibitory activity against Listeria monocytogenes after eliminating the effect of organic acid and hydrogen peroxide；the inhibitory activity of strains MHY3-2 and MD-2 were strongly dependent on the organic acid，whereas the influence of organic acid produced by strains MB2-1 and MD-1 on the inhibitory activity were negligible.CFSs of strains MB2-1 and MD-1 after eliminating organic acid and hydrogen peroxide show significant antibacterial activity against Listeria monocytogenes among 9 strains.The activity of all tested strains was lost by treating with pepsin and trysin but strains MB2-2 and MD-1 not sensitive to trypsin.The results demonstrated that the inhibitory compound was proteinaceous in nature and likely is bacterion-like or bacterion.In addition，antibiotic resistance of 9 strains of lactic acid bacteria was preliminarily tested.9 strains were sensitive to ampicillin，vancomycin，erythromycin，chloramphenicol，ciprofloxacin and norfloxacin.The safety aspects of strains with inhibitory activity studied could provid basis for exploitarion and application of lactic acid bacteria isolated from the intestine of cold water fish.

inhibitory activity；lactic acid bacteria；screening；physiological property

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.031

2013－10－28 *通訊聯系人

任士菊（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

國家自然科學基金（31360001）；新疆生產建設兵團博士資金專項（2011BB009）；石河子大學自然科學重點學科（ZRKX20104001）。