一種羊酸奶發酵劑的富硒工藝研究

張海濤，牛 林，淡瑞芳（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300）

一種羊酸奶發酵劑的富硒工藝研究

張海濤，牛 林，淡瑞芳*
（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300）

以菌體中含硒量為指標，確定加硒和富硒培養時間、培養溫度、菌種接種比例，采用正交實驗對加硒濃度、接種量、培養pH和低聚果糖添加量4個較為重要的富硒因素進行優化。結果表明：單因素實驗確定加硒時間為菌體培養開始后24h，富硒培養時間60h，培養溫度41℃，長雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌按2∶1混合培養。以菌體含硒量為考察指標，獲得最佳發酵條件為：混合菌接種量3%，硒的質量濃度8μg/g，低聚果糖質量濃度1.00%，pH6.5，此時酸奶發酵劑中硒含量約33.46μg/kg。

羊酸奶，發酵，富硒條件，優化

硒（selenium）是人體所必需的微量元素[1]，它對人體的正常代謝起著重要的調節作用。缺硒可能導致癌癥和心肌梗塞等多種疾病的發生，通過膳食攝取足夠的硒，可起到預防有關疾病的作用[2-3]。中國營養學會推薦正常人體硒攝入量為60～200μg/d。根據我國13省市營養調查報告結果，調查區域內普遍存在硒攝入量不足的問題，成人每日人均硒攝入量僅為26.36μg[4]。按照形態分類，硒可分為有機硒和無機硒兩種，但無機硒毒性高，而有機硒具有吸收利用率高并且且副作用小的優點，所以硒的生物轉化是一條安全有效的途徑[5]。研究表明乳酸菌具有優良的富硒能力[6-7]，是一種有機硒的良好來源。隨著硒對人體的功效認識的逐漸深入，開發富硒產品已引起各方面的重視，特別是開發富硒保健食品，針對各種由于缺硒而帶來的疾病預防具有非凡的意義。

羊奶富含蛋白質、乳糖、脂肪、多種維生素和礦物質元素，具有多種保健功能、易于吸收，是世界上公認的最接近人奶的奶品，也是現代人類健康的“營養佳品”[8]，但羊奶硒含量低于牛奶，因此，利用羊奶開發富硒酸奶，可以更好發揮羊乳的保健功能，推進羊乳產業的發展，起到積極的作用。本文以長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌作為發酵菌種，通過單因素實驗依次考察影響菌體含硒量的各個因素，選取較優的水平進行正交實驗，以硒含量為考察指標確定出富硒羊酸奶的主要發酵劑生產工藝，以期為富硒羊酸奶的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長雙歧桿菌lb05 上海信然生物技術有限公司；嗜酸乳桿菌sl05 江蘇沃爾德實業有限公司；蛋白胨（生化試劑） 湖北輝華生物有限公司；牛肉浸粉（生化試劑） 上?？婆d生化試劑有限公司；酵母浸膏（生化試劑） 宜興市江山生物制劑有限公司；亞硒酸鈉（食品級） 鄭州錦德化工有限公司。

NDJ-7粘度計 深圳市恒盛豐工貿有限公司；Forma1029厭氧培養系統 北京晨時科儀商貿有限公司；SKD-600自動凱氏定氮儀 南京創睿儀器儀表有限公司；DNP-9082恒溫培養箱 常州市偉嘉儀器制造有限公司；PHS-3cpH儀 深圳市卡迪亞科技有限公司；KXX-5-12馬弗爐 上虞市鑫達實驗設備廠；FD-IB-50冷凍干燥機 臺灣臺大電子（東莞）有限公司；MARK MW3系列電子天平 鉑悅儀器（上海）有限公司；DZF-6021真空干燥箱 上海杰偉福電子商務有限公司；SW-CJ-1F雙面凈化工作臺 上?？德穬x器設備有限公司；MWCO3500透析袋 上海源葉生物科技有限公司；羅茲哥特里抽脂瓶 北京朋利馳科技有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 液體MRS培養基 蛋白陳10g、牛肉浸粉8g、酵母浸膏9g、葡萄糖20g、KH2PO 2g、檸檬酸氫二銨2g、CH3COONa 5g、MgSO40.2g、MnSO40.04g、Tween 80mL、蒸餾水1000mL，pH為5.7±0.2，121℃滅菌20min；液體MRS改良培養基：于MRS液體培養基中添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽121℃滅菌20min；固體MRS培養基 于MRS液體培養基中添加14g的瓊脂，121℃滅菌20min；MRS-raffinose：在MRS固體培養基中添加1%的棉籽糖、0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和0.05% LiCl于121℃滅菌20min；全脂羊乳培養基 復原羊乳92%、蔗糖6%、低聚異麥芽糖1%、酪蛋白酸鈉1%、Na2SeO340μg/kg，108℃滅菌20min。

1.2.2 混合菌體富硒培養方法 配制一定濃度亞硒酸鈉溶液，滅菌待用。在無菌操作條件下，按照一定比例將亞硒酸鈉溶液加至改良液體MRS培養基中，搖勻，接入長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05。在37℃下培養72h，然后將混合菌體培養物在4℃，10000r/min條件下，離心10min，棄上清液，用去離子水洗滌3次，置于真空干燥箱中干燥（50℃，-0.1MPa）至恒重，得混合菌體。

1.2.3 菌體有機硒含量的測定 取1g富硒發酵劑加入截留分子質量為3500u透析袋中，并置于去離子水中透析至無硒析出時，說明無機硒已經全部析出，再將其在4℃，10000r/min條件下，離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，60℃干燥至恒重，然后參考石墨爐原子吸收法測定[9]，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 益生菌富硒條件的單因素實驗

1.2.4.1 不同硒濃度對菌體富硒效果的影響 配制硒酸鈉含量分別為2、4、6、8、10μg/g培養基，測定lb05、sl05純菌種和lb05∶sl05為1∶1混合菌種在37℃條件下，發酵50h后的菌體硒含量。

1.2.4.2 加硒時間對菌體富硒效果的影響 采用lb05∶sl05為1∶1混合菌種，分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32h添加亞硒酸鈉溶液，調節培養基硒含量為6μg/g，測定在37℃條件下，發酵50h后的菌體硒含量。

1.2.4.3 培養時間對菌體富硒效果的影響 采用lb05∶sl05為1∶1混合菌種，發酵6h后，調節培養基硒含量為6μg/g，分別培養36、48、60、72、84h后，測定菌體硒含量。

1.2.4.4 發酵溫度和初始pH對菌體含硒量的影響 調節培養基初始pH分別為5.0、6.0、7.0，分別在33、35、37、39、41、43℃的培養溫度培養60h，測定菌體硒含量。1.2.4.5 接種比例和接種量對菌體含硒量的影響 按照長雙歧桿菌：嗜酸乳桿菌=1∶1、2∶1、3∶1、2∶3、1∶2比例進行對菌種進行復配，調節培養基pH為6.0，按照體積分數的1%、2%、3%、4%、5%接種，在41℃條件下培養60h，測定菌體硒含量。

1.2.4.6 低聚糖及其含量對菌體含硒量的影響 液體改良MRS培養基中等量的葡萄糖分別按照0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的比例以低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚異麥芽糖代替，調節培養基pH為6.0，添加復合菌種（lb05∶sl05=2∶1）3%，在41℃條件下培養60h，測定菌體硒含量。

1.2.5 正交實驗優化益生菌的富硒條件 在單因素實驗結果基礎上，選取接種量、硒濃度、pH及低聚果糖添加量進行四因素三水平正交實驗，因素水平表見表1，制作發酵羊酸奶發酵劑，以羊酸奶發酵劑中硒含量作為考察指標。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test factors L9（34）

1.2.6 液態及固態富硒羊酸奶發酵劑的制備 收集長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合富硒培養產物，將其置于50mL無菌離心管內，10000r/min，4℃冷凍離心10min。取一定量的預先經過108℃滅菌20min的10%脫脂復原羊乳，沖洗菌體并稀釋至約4×108cfu/mL濃度，制備得液態富硒羊酸奶發酵劑。制備所得液態發酵劑置于-80℃低溫冰箱內預凍2h，以冷凍溫度-50℃，真空度20Pa，真空冷凍干燥約48h，即得固態富硒羊酸奶發酵劑。

2 結果與分析

2.1 硒濃度對菌體含硒量的影響

不同硒濃度對菌體含硒量的影響如圖1所示，硒濃度在2～10μg/g范圍內，長雙歧桿菌lb05、嗜酸乳桿菌sl05及其混合（1∶1）菌體中含硒量均先上升，后增加不顯著，其中混合菌種富硒效果顯著，在加硒濃度為6μg/g時，混合菌種富硒效果最佳，菌體含硒量為532μg/g，含量最高。因此，選擇以長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05按1∶1的混合比例培養富硒。在后續的正交實驗中以6μg/g為中間值進一步優化最適的硒濃度值。

2.2 加硒時間對菌體含硒量的影響

加硒時間對菌體含硒量的影響如圖2所示，長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合富硒培養后24h時加硒，菌體中含硒量達最高值488μg/g，這是由于生長階段不同，微生物對硒的吸收利用率也不同[8]。實驗結果表明培養至24h加硒效果最理想，實驗所用菌株種類不同，菌株的性質決定了在菌株的不同生長階段轉化的硒能力有差別，所以加硒時間有先后差異。

圖1 不同硒質量濃度對菌體含硒量的影響Fig.1 Content of selenium in cells with different concentration of the selenium

圖2 不同加硒時間下菌體含硒量Fig.2 Content of selenium in cells in different selenium-added time

2.3 培養時間對菌體含硒量的影響

不同培養時間下菌體含硒量影響如圖3所示，長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合培養36～60h時，菌體含硒量呈上升趨勢，而在60～84h范圍內，菌體中含硒量呈下降趨勢。因此，適宜的培養時間為60h。

圖3 不同培養時間下菌體含硒量Fig.3 Different cell culture time selenium content

2.4 發酵溫度和初始pH對菌體含硒量的影響

發酵溫度和初始pH對菌體含硒量的影響如圖4所示，在37～41℃范圍內，菌體含硒量隨溫度上升而增加，而大于41℃時呈下降趨勢。此外，pH為6.0時，菌體中硒含量（518μg/g）明顯高于pH5.0和pH7.0時的硒含量（分別為498μg/g和486μg/g）。因此，選擇適宜的富硒培養溫度為41℃，pH為6，并在后面的正交實驗中以6.0為中間值進一步優化最適發酵pH。

圖4 不同溫度和pH下菌體含硒量Fig.4 Content of celenium in cells under different innital pH and culture temperature

2.5 接種比例和接種量對菌體含硒量的影響

接種比例和接種量對菌體含硒量的影響如圖5所示，當接種量從1%升至3%時，不同混合比例的菌體含硒量隨接種量增加而呈上升趨勢。而從3%進一步升到5%時，接種比（菌株lb05∶sl05）為1∶1、2∶1、2∶3和1∶2的菌體含硒量增加量均不顯著，所有組別中的高峰值出現在接種量為3%時，其中接種比例為2∶1時，此時菌體含硒量達到548μg/g，次高峰值為同組的1∶1比例混合樣，菌體含硒量為530μg/g。因此，確定長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合比例為2∶1，并在后續的正交實驗中以3%接種比例為中間值進一步優化最佳的接種量。

圖5 不同接種比例與接種量下菌體含硒量Fig.5 Content of selenium in cells with different inoculation ratio and amount

2.6 低聚糖及其含量對菌體含硒量的影響

低聚糖及其含量對菌體含硒量的影響如圖6所示，添加低聚糖能不同程度地促進兩種乳酸菌的富硒能力。其中以低聚果糖的作用最為顯著，在其添加量為1%時，菌體含硒量可高達530μg/g。作為乳酸菌生長過程中主要的“食物來源”（即通常所稱的“益生元”），低聚果糖、木糖、異麥芽糖等因為分子結構上的差異，使得這些益生菌在將其分解，獲取能量上的效率不同，生長速度上也不同，導致最終的菌體含硒量出現較大差距[12]。在后續的正交實驗中，將以1%作為中間值，進一步研究低聚果糖的最優添加量。

圖6 不同低聚糖及其含量下的菌體含硒量Fig.6 Content of selenium in cells with different oligo and content

2.7 羊酸奶發酵劑富硒條件優化正交實驗

依據單因素實驗結果，重點選取接種量、硒濃度、pH及低聚果糖添加量進行四因素三水平正交實驗。制作羊酸奶發酵劑，以羊酸奶發酵劑中的含硒量作為考察指標，結果見表2。由表2可知，當以“羊酸奶發酵劑含硒量”作為考察指標時，最佳的水平組合為A2B3C3D2。即混合菌接種量3%，硒的質量濃度8μg/g，pH6.5，低聚果糖質量濃度1%。按照優化后的條件進行驗證實驗，3次實驗酸奶發酵劑中平均硒含量為33.46μg/g。

表2 接種量、硒濃度、pH及低聚果糖正交實驗結果Table 2 Inoculation,selenium concentration，pH and oligofructose orthogonal test results

3 結論

通過研究了加硒濃度、加硒時間、發酵時間、發酵溫度、發酵初始pH、接種量、各菌株混合比例、添加的低聚糖種類和濃度等工藝條件對羊酸奶中含硒量的影響。在單因素實驗基礎上，采用正交實驗設計對酸奶發酵工藝進行優化，獲得最佳發酵條件為：混合菌接種量3%，硒的質量濃度8μg/g，pH6.5，低聚果糖質量濃度1%。此時酸奶發酵劑中硒含量約33.46μg/kg。說明長雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05具有良好地富硒能力，發酵的羊酸奶能很好的補充人體硒元素，為富硒羊酸奶發酵的工業化生產提供可靠的理論依據。

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Study on the fermentation condition of Goat yogurt for selenium-enriched

ZHANG Hai-tao，NIU Lin，DAN Rui-fang*
（Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China）

The impact of the different fermentation conditions was studied on selenium-enriched of the fermentated goat yogurtionthrough single factor screening and orthogonal experimental.The temperature，culture time of selenium-enriched，incubation temperature and the proportion of inoculation was determined by using selenium content in the bacteria as the index.The fourimportant factors including selenium concentration，inoculum size，culture pH and the added amount of oligofruc to selenium were optimized through orthogonal test.The results showed that the single-factor test to selenium was riched after 24 hours of bacteria cultivation，incubated for 60h at 41℃ with ratio of Bifidobacterium longum，Lactobacillus acidophilus 2∶1 mixed culture through single-factor test.The orthogonal test was done according to the selenium content as the index.The best fermentation conditions were as follow：mixed inoculum of 3%，selenium concentration of 8μg/g，pH6.5，and 1.00%fructo-oligosaccharides by selenium content in yogurt as the main index.The selenium content of goat yogurtion was 33.46μg/kg.

Goat yogurt；fermentation；selenium-enriched；optimization

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.041

2013-09-13 *通訊聯系人

張海濤（1974-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：農產品加工與貯藏。