阿拉伯呋喃糖苷水解酶對啤酒大麥麥芽過濾性能的影響

高 飛，金 昭，蔡國林，董建軍，陸 健，5，*（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫21122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫21122；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫21122；.啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東青島266061；5.宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇宿遷223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶對啤酒大麥麥芽過濾性能的影響

高 飛1，2，3，金 昭1，2，3，蔡國林1，3，董建軍4，陸 健1，2，3，5，*
（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；4.啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東青島266061；5.宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇宿遷223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶（Arabinoxylan arabinofuranohydrolase，AXAH）是阿拉伯木聚糖完全降解的關鍵酶之一。本文比較了過濾性能差異顯著的江蘇單二和港啤大麥麥芽與進口Metcalfe和Baudin大麥麥芽中的AXAH活力，發現單二和港啤中的AXAH平均活力只是Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。為了進一步確定AXAH對大麥麥芽過濾性能的影響，文章通過硫酸銨分級沉淀、SP FF和Q FF離子柱層析以及Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析技術對單二大麥麥芽中AXAH進行了純化，并將其添加到協定糖化過程的起始階段。結果發現，當加酶量達到6mU/g時，協定糖化麥汁的過濾速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麥汁濁度增加了32.5%。這一結果表明，添加AXAH及其與其他水解酶協同作用，促進了多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖以及高分子氮的降低，也促進了阿拉伯木聚糖和麥汁總氮含量的升高。

大麥麥芽，過濾性能，阿拉伯呋喃糖苷水解酶，協定糖化

大麥麥芽是啤酒釀造的主要原料之一，其品質的優劣直接影響著啤酒釀造的整個生產過程。過濾性能是評價大麥麥芽質量的重要參數之一，主要包括過濾速度、粘度及濁度三個方面。江蘇是中國主要的啤酒大麥產區之一，然而部分江蘇啤酒大麥麥芽質量相對于進口的品質優良啤酒大麥（如加拿大Metcalfe品種）制得的麥芽有著明顯的差距，過濾性能缺陷就是其中之一，如因麥芽制得麥汁的過濾速度緩慢而延長了麥汁的生產時間，麥汁濁度高而易引起啤酒的非生物渾濁等質量問題[1-2]，這已嚴重影響了部分江蘇大麥麥芽在中國啤酒行業中的應用。

麥芽中大分子物質的不完全降解，是造成麥汁過濾速度慢的直接原因，這些大分子物質主要包括阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）、β-葡聚糖和蛋白[3-4]。近年來，阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖（PAX）對過濾性能的影響得到了越來越多的關注[5-7]。阿拉伯木聚糖降解酶之一的阿拉伯呋喃糖苷酶，可通過降解阿拉伯呋喃糖單元來加速木聚糖內切酶等的催化水解作用。而屬于阿拉伯呋喃糖苷酶GH51家族的AXAH，具有其他阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。AXAH通過催化水解去除阿拉伯木聚糖上的阿拉伯呋喃糖苷殘基，改變空間構型，促進酶-底物復合物的形成，并與木聚糖內切酶等協同作用，可顯著加快阿拉伯木聚糖的降解速度。金昭[9]采用基于熒光差異雙向電泳的比較蛋白質組學策略，比較了江蘇單二大麥麥芽與加拿大Metcalfe大麥麥芽的代謝蛋白質組，蛋白質的差異包括Metcalfe中兩個豐度比單二高的AXAH-I斑點。國內外對AXAH的研究較少，其對過濾性能影響的研究至今沒有報道。

本文在金昭通過蛋白質組學研究麥芽過濾性能影響因素的基礎上，比較了過濾性能差異顯著的江蘇單二和港啤大麥麥芽與進口Metcalfe和Baudin大麥麥芽中的AXAH活力，并考察了其對過濾性能的影響，希望為進一步闡明影響江蘇啤酒大麥麥芽過濾性能缺陷的因素提供參考，也為從基因水平修復江蘇啤酒大麥麥芽過濾性能的缺陷提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

商品麥芽 大麥品種為Metcalfe大麥（2012年，加拿大），Baudin大麥（2012年，澳大利亞），單二及港啤大麥（2012年，中國江蘇）四種大麥麥芽均由國內同一麥芽生產公司提供；溴酚藍、TEMED等 均為GE公司產品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250等 均為上海生工進口分裝產品；4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷 為西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；對硝基酚、無水乙醇、甘油、正丁醇、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸、丙酮、三羥氨基甲烷、醋酸鈉、醋酸、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉等 均為國產分析純產品。

MALDI-TOF-TOF型串聯質譜 美國布魯克-道爾頓公司；AKTA avant 25型蛋白純化系統、HiPrep 16/10 Q FF及HiTrap 16/10 SP-FF型層析柱、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR等 均為GE公司產品；Pico＆Fresco 17型微量高速冷凍離心機、Haake型落球式粘度計 Thermo公司；UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；Spectra Max Plus 384型酶標儀、Molecular Devices、JD-801型凝膠電泳圖像分析系統 江蘇省捷達科技發展有限公司；自動糖化器 輕工部西安輕機所光電公司；麥芽標準粉碎機 北京德之杰啤酒技術有限責任公司；WGZ-2-PJ型濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽常規指標的測定 具體方法詳見參考文獻[10]。

1.2.2 麥芽中AXAH的酶活測定 取一定量的麥芽樣品研磨為細粉，與pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液按1∶4混合，室溫振蕩30min，10000r/min離心10min，取上清液即得酶液樣品。

采用Ferre H等[11]建立的檢測阿拉伯呋喃糖苷水解酶酶活的方法測定。取0.5mL底物（0.5mmol/L）與適當稀釋的酶液，40℃條件下反應30min，立即加入1mL 0.5mol/L的Na2CO3終止反應。于410nm波長處比色，以底物、鈍化酶等反應體系為空白。

酶活定義：每分鐘反應水解1滋mol對硝基苯酚所需的酶量，定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.3 AXAH-I的分離純化[8，11]取單二大麥麥芽細粉，與pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸鹽緩沖液以1∶4混合，4℃浸提過夜。將浸提液8000r/min離心15min，取上清液加入硫酸銨至飽和度20%去除部分雜蛋白，再在上清液中繼續加入硫酸銨至飽和度40%，沉淀復溶并用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，所得即為粗酶液。將透析后酶液上樣于HiTrap 16/10 SP FF陽離子交換柱（設定洗脫流速為4mL/min，每管收集4mL）并檢測收集管的酶活力，收集有酶活的組分濃縮、調整pH5.2后上樣于HiPrep 16/10 Q FF陰離子交換柱（設定洗脫流速為4mL/min，每管收集4mL），收集有酶活的組分進行濃縮處理后上樣于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝膠柱（設定洗脫流速為0.5mL/min，每管收集1mL）檢測每管洗脫液的酶活力，收集具有酶活的組分進行冷凍干燥備用。

1.2.4 蛋白質含量測定 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍G250法[12]，以牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.2.5 AXAH-I的鑒定 采用SDS-PAGE（其分離膠質量濃度為12.5g/100mL，濃縮膠質量濃度為5g/100mL）、串聯質譜（MALDI-TOF/TOF）分析和蛋白質數據庫（NCBInr）檢索（http：//www.matrixscience.com/）[13]進行蛋白質鑒定。

1.2.6 AXAH-I的添加實驗 在單二麥芽糖化的起始階段添加純化的AXAH-I，添加的酶量為單二和港啤麥芽與Metcalfe和Baudin麥芽平均AXAH-I活力差距（4mU/g）的0.5～1.5倍，即0、2、4和6mU/g。糖化結束后，測定麥芽的過濾性能及相關指標。

2 結果與討論

2.1 不同品種大麥麥芽過濾性能的比較

通過協定糖化法，四種麥芽制得麥汁的相關指標如表1所示。從表1可得Metcalfe、Baudin大麥麥芽的品質明顯優于單二、港啤大麥麥芽品質，與過濾性能相關的各項指標也具有明顯優勢：進口Metcalfe和Baudin麥芽協定麥汁的在過濾速度顯著高于單二和港啤麥芽；而單二和港啤麥芽的濁度、粘度、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖含量高于Metcalfe和Baudin麥芽。

麥芽中的大分子物質（主要為β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、蛋白質和多酚）被普遍認為是引起麥汁過濾性能差的主要物質。金昭發現這些大分子物質在單二和Metcalfe麥芽的協定麥汁之間含量差別較大，而在這兩個品種的大麥之間的差別很小[9]?？赏茢啵呋蠓肿游镔|代謝相關的酶在單二、港啤和Metcalfe、Baudin麥芽之間存在著差異。而目前市場上針對于麥芽過濾性能缺陷開發出了多種酶制劑，β-葡聚糖內切酶、阿拉伯木聚糖內切酶、蛋白酶是主要成分，但是江蘇啤酒大麥麥芽的過濾性能仍然沒有明顯的改觀。因此，需要考察參與這些大分子物質代謝的其他酶類。

2.2 麥芽中AXAH活力的測定

大麥中AXAH有兩個同功酶AXAH-I和-II，AXAH-I已被證明存在，而AXAH-II是根據基因序列推測出來的，目前仍未被證實[8]。本實驗測定了2012年的江蘇單二、港啤大麥麥芽和Metcalfe、Baudin大麥麥芽中AXAH活力（如圖1所示）。發現江蘇單二和港啤麥芽中的AXAH平均活力比Metcalfe和Baudin中平均活力低了4mU/g，只相當于Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。

圖1 不同品種麥芽的AXAH活力Fig.1 Activities of AXAH in different types of malts

阿拉伯木聚糖的完全降解需要一系列木聚糖降解酶，主要包括木聚糖內切酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶[14]。AXAH能從谷物細胞壁阿拉伯木聚糖上釋放L-阿拉伯糖，主要作用于阿拉伯木聚糖主鏈上C（O）3鏈接的α-L-阿拉伯呋喃糖苷單取代基和雙取代基，且其能與其他酶協同作用快速降解阿拉伯木聚糖，而大麥AXAH更具有其他α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。因此，單二大麥麥芽中較低的AXAH活力是導致其過濾性能差的一個不利因素。

2.3 AXAH-I的分離純化

圖2 HiTrap SP FF柱層析洗脫圖譜Fig.2 Cation exchange SP FF chromatography

圖3 HiTrap Q FF柱層析洗脫圖譜Fig.3 Anion exchange Q FF chromatography

表1 不同品種麥芽常規指標及過濾性能的比較Table 1 Comparison of malt quality parameters and filterability between Daner and Metcalfe malt

粗提取樣品進行20%～40%飽和度的硫酸銨沉淀后所得的粗酶液先上樣于HiTrap SP FF柱，將穿透峰中有酶活部分（如圖2所示）收集混合（結合Ferre H等[11]的研究不收集洗脫峰中酶活部分），調整pH為5.2后，再上樣于HiPrep 16/10 Q FF柱，收集洗脫峰中有酶活部分（如圖3所示）。將收集樣品處理后，再上樣于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，收集最終純化得到的AXAH酶樣品（如圖4所示）。

圖4 Sephacryl S-100 HR凝膠柱層析洗脫圖譜Fig.4 Sephacryl S-100 HR chromatography

分離純化的SDS-PAGE凝膠電泳結果如圖5所示，泳道5的兩個條帶經質譜鑒定分析結果顯示都為arabinoxylan arabinofuranohydrolase isoenzyme AXAH-I[Hordeum vulgare]（登錄號為gi13398412），且Mr為72557，pI為5.05。這一結果與金昭[9]的蛋白質組學鑒定結果相符，也與Robert C L等[8]和Ferre H等的實驗結果一致，60ku左右的條帶為蛋白質翻譯后修飾體。

圖5 AXAH-I純化各階段SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE of protein fractions during the purification of AXAH-I

2.4 AXAH-I對江蘇單二啤酒大麥麥芽過濾性能的影響

在單二麥芽的協定糖化過程中添加純化的AXAH-I，隨著AXAH-I添加量的增加，麥芽的過濾性能變化及相關物質指標如表2所示。

由表2可見，隨著AXAH-I添加量的增加，麥汁的過濾速度和浸出率逐步升高，粘度降低，濁度升高。當酶添加量為6mU/g時，過濾速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麥汁濁度增加了32.5%。阿拉伯木聚糖和總氮含量隨著酶添加量的增加而增加，這說明添加AXAH-I到糖化過程中，促進了阿拉伯木聚糖和蛋白質的溶解，而在AXAH-I及其與其他水解酶的協同作用下，PAX和高分子氮的含量不斷減小。總體而言，β-葡聚糖含量隨著AXAH-I添加量的增加而降低。據Kanauchi M等報道，阿拉伯呋喃糖苷酶可促進β-葡聚糖的溶解[15]。但由于剛果紅法只檢測高分子量的β-葡聚糖，所以本研究里沒有充分反映添加AXAH-I對β-葡聚糖溶解的影響。

PAX、β-葡聚糖及高分子蛋白質的不充分降解，就會引起麥汁粘度高，麥汁過濾困難和導致渾濁等問題。同時，它們的降解程度，限制著其他酶進入胚乳細胞壁，進而影響到胚乳的溶解。胚乳細胞以淀粉顆粒為核心，外層主要包裹著β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和少量的纖維素，細胞之間有蛋白質交聯[16]，蛋白質易與多酚結合形成可溶性復合物，這些可溶性復合物變成膠體顆粒，并隨之逐漸變大，從而引起麥汁渾濁等[17]。研究結果可證明，在過濾性能顯著差異的單二、港啤和Metcalfe、Baudin麥芽之間AXAH活力差異較大，且分離純化的AXAH-I通過改善大分子物質的溶解和促進它們的降解而對麥芽的過濾性能有著重要的影響。

表2 AXAH-I對單二麥芽過濾性能的影響Table 2 Effect of AXAH on the filterability of Dan’er malt

3 結論

在采用比較蛋白質組學手段研究發現江蘇單二大麥麥芽AXAH-I的表達豐度比加拿大Metcalfe大麥麥芽中較低的基礎上，本研究進一步比較了四種麥芽中AXAH的活力，發現單二、港啤大麥麥芽中AXAH的平均活力只相當于Metcalfe和Baudin中的60%。從單二大麥麥芽中分離純化得到AXAH-I，并將其添加到單二麥芽糖化過程中，發現加入AXAH-I后，在其自身作用及其與其他水解酶的協同作用下，促進了蛋白質和阿拉伯木聚糖的溶解，以及高分子蛋白質、PAX和β-葡聚糖的降解。并且，隨著AXAH-I添加量的增加，麥芽的過濾速度和粘度得到逐漸的改善。而麥汁濁度的升高主要是由于單二大麥麥芽在其他代謝蛋白質方面也存在缺陷問題，比如β-淀粉酶的不足?？傮w而言，糖化過程中彌補所缺失的AXAH-I有利于大分子物質的溶解和降解，促進其麥芽品質的改善。其可應用于改善江蘇啤酒大麥麥芽過濾性能的研究。

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Effect of arabinoxylan arabinofuranohydrolases of Jiangsu barley malt on the filterability

GAO Fei1，2，3，JIN Zhao1，2，3，CAI Guo-lin1，3，DONG Jian-jun4，LU Jian1，2，3，5，*
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer，Qingdao 266061，China；5.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，888 Renmin Road，Suqian 223800，China）

Arabinoxylan arabinofuranohydrolase（AXAH）is one of the key degrading enzymes of arabinoxylan.The activitiesofAXAHbetweenJiangsubarleymalt（Dan’erandGangpi）andimportedbarleymalt（MetcalfeandBaudin）with different filterability were compared，the results found that AXAH average activities in Dan’er and Gangpi was only about 60%of that in Metcalfe and Baudin.In order to confirm effect of AXAH on the malt filterability，AXAH was isolated from Dan’er barley malt by ammonium sulfate precipitation，SP FF and Q FF ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography，and was then added into mash during the initial period of congress mash.The filtration rate of wort increased 34.2%when 6mU/g of AXAH was added，the viscosity decreased 5.5%but the turbidity increased 32.5%.These results showed that the added AXAH and its synergistic effect with others hydrolases promote the decrease of contents of polymeric arabinoxylans（PAX），β-glucan and macromolecular nitrogen，but the increase of contents of AX and total nitrogen of wort.

barley malt；filterability；arabinoxylan arabinofuranohydrolase；congress mash

TS261.2

A

1002-0306（2014）14-0237-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.044

2013－09－27 *通訊聯系人

高飛（1988-），男，碩士研究生，研究方向：釀酒科學與工程。

國家自然科學基金項目（31171736）；國家863計劃（2013AA102109）；江蘇省普通高等學?？蒲谐晒a業化推進項目（JHB2012-26）；江蘇省科技支撐計劃（BE2012397）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助（JUDCF10047）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。