殼聚糖澄清葛根提取液的工藝優化

吳湛霞，楊錫洪，李思東，劉莉莉，陳曉琪（.廣東海洋大學理學院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

殼聚糖澄清葛根提取液的工藝優化

吳湛霞1，楊錫洪2，*，李思東1，劉莉莉1，陳曉琪1
（1.廣東海洋大學理學院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

以葛根黃酮轉移率、提取液透光率為指標，通過單因素實驗和正交實驗對澄清工藝進行優化，探討了殼聚糖對葛根提取液澄清作用的影響。結果表明，殼聚糖用于澄清葛根提取液的最佳工藝條件為：殼聚糖分子量為400ku，殼聚糖用量為0.16g/100mL，溫度為60℃，pH為5.5。在此條件下，黃酮轉移率為73.25%，葛根澄清液透光率為97.9%，殼聚糖澄清葛根提取液的效果較好，葛根的有效成分也得到較好的保留。

葛根提取液，殼聚糖，黃酮，澄清

葛根為野葛的干燥根，是常用中藥材，具有退熱止瀉等功效，在保健品中它可緩解頭痛、泄瀉、高血壓等癥狀[1-3]。葛根的活性成分有如下幾類：異黃酮類，主要包括葛根素、大豆苷等；葛根苷類，主要包括葛根苷A、B、C 3種；三萜皂苷類；生物堿及其他化合物。近代藥理研究中最受關注的是葛根素等異黃酮類活性成分，其制劑對頭痛、高血壓、腹瀉等疾患療效顯著[4-9]。異黃酮類物質作為葛根的主要活性成分，其保健功能也逐漸為人們所認可。近年來，各種葛根制劑及葛根功能飲料不斷被開發研制[10]，如何優化葛根提取液澄清工藝成為研究的主攻方向。目前對葛根提取液進行澄清的經典方法是醇沉法，但已有報道指出將乙醇作為澄清劑有諸多不合理性，如將不溶于醇的無機物作為雜質除去不夠妥當，且具有生物活性及免疫作用的蛋白質、多糖也極易被醇沉除去。此外，醇沉工藝耗時長、成本高，成品中殘存的乙醇可能對藥效有一定影響[11]。

20世紀90年代以來，國內外學者對天然高分子絮凝劑的研究開發產生了濃厚興趣，淀粉改性陽離子絮凝劑、殼聚糖衍生物、木質素改性絮凝劑等逐漸成為新的研究熱點[12]。其中殼聚糖澄清劑因資源豐富、成本低、使用簡便等優點倍受關注。殼聚糖絮凝法用于中藥制劑澄清工藝的研究已有報道[13]，但其用于澄清葛根提取液還少見報道。本文以葛根為原料，對殼聚糖澄清葛根提取液的工藝條件進行探討，并得出殼聚糖澄清葛根提取液的最佳工藝，為工業化生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

400ku分子量殼聚糖、700ku分子量殼聚糖、3～5ku分子量殼聚糖 廉江市臺興海洋生物科技有限公司；葛根塊 湛江市鴻中藥店霞山分店；95%乙醇、冰醋酸、無水乙醇 分析純，廣東光華化學廠有限公司；鹽酸 分析純，廣州化學試劑二廠；葛根素對照品 純度99%，上海廣銳生物科技有限公司。

HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限醫療設備廠；PHS-25型pH計 上海偉業儀器廠；UV-5500型紫外可見分光光度計 上海分析儀器有限公司；UV 1800PC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；SHB型循環式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；RE52CS型旋轉蒸發儀 上海亞萊生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根提取液的制備 稱取一定量葛根塊，加入30%（體積分數）的乙醇溶液加熱回流提取兩次：第一次乙醇添加量為葛根質量的6倍，提取時間為2h；第二次乙醇添加量為葛根質量的4倍，提取時間為1h，然后將兩次提取液合并，過濾備用。

1.2.2 葛根提取液黃酮含量的測定 對照樣溶液的制備：準確稱取80℃干燥至恒重的葛根素對照品5.0mg于容量瓶（25mL）中，添加30%（體積分數）的乙醇水溶液，溶解定容后放置備用。

標準曲線的繪制：按照分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄VA）在250nm的波長處測定吸收度，繪制標準曲線。

待測液含量測定：取1.00mL待測液于50mL容量瓶中，用30%（體積分數）的乙醇溶液定容，以30%（體積分數）的乙醇溶液作空白對照，在250nm的波長處測定其吸收度，得待測液含量。

1.2.3 葛根提取液透光率的測定 取待測液適量，以蒸餾水為空白，于600nm最佳波長下測定透光率，透光率的大小間接反映待測液的澄清度，透光率越大，澄清度越好。

1.2.4 澄清前葛根提取液黃酮含量及透光率的測定 取1.00mL葛根提取液于50mL容量瓶中，用30%（體積分數）的乙醇溶液定容，測定其吸光度，計算其黃酮含量及透光率。

1.2.5 殼聚糖澄清葛根提取液的工藝 殼聚糖澄清劑的制備：用1%（體積分數）的乙酸溶液為溶劑配制1%（質量體積分數）的殼聚糖溶液，室溫完全溶解后立即使用，以防殼聚糖在稀酸中緩慢水解而影響絮凝效果。

黃酮轉移率的計算：葛根提取液經殼聚糖或乙醇澄清，澄清后的葛根提取液中黃酮含量與澄清前葛根提取液中黃酮含量的比值。

1.2.5.1 單因素實驗 殼聚糖用量對透光率和黃酮轉移率的影響：準確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，調節pH為5.0，在60℃下水浴攪拌，并依次加入2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL的1%（質量體積分數）殼聚糖乙酸溶液，即殼聚糖用量分別為0.08、0.12、0.16、0.20、0.24g/100mL（殼聚糖用量表示為每100mL葛根提取液中殼聚糖的加入量（g））。低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷卻至室溫，靜置24h后過濾，取上清液，測定透光率及吸光度。

提取液pH對透光率和黃酮轉移率的影響：準確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，分別調節pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，60℃水浴攪拌下加入4.00mL的1%（質量體積分數）殼聚糖乙酸溶液，即殼聚糖用量為0.16g/100mL，低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷至室溫，靜置24h，過濾，取上清液，測定透光率及吸光度。

提取液溫度對透光率和黃酮轉移率的影響：準確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，調節pH為4.0，分別在30、40、50、60、70℃條件下水浴，加入4.00mL的1%（質量體積分數）殼聚糖溶液，即殼聚糖用量為0.16g/100mL，低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷至室溫，靜置24h后過濾，取上清液，測定透光率及吸光度。

1.2.5.2 正交優化實驗 由上述單因素實驗得出殼聚糖用量、pH和提取液溫度的3個水平，建立因素水平表（見表1），以葛根溶液透光率和黃酮轉移率為指標，采用正交實驗確定最佳殼聚糖用量、pH和提取液溫度。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 殼聚糖分子量與提取液透光率和黃酮轉移率的關系 取提取液25.00mL，分別在最優條件下加入最佳用量的分子量（M）分別為400、700、3～5ku殼聚糖，靜置24h后過濾，取上清液測定葛根黃酮含量及透光率，計算黃酮轉移率。

1.2.7 殼聚糖澄清葛根提取液與傳統工藝比較 取葛根提取液25.00mL，添加95%（體積分數）的乙醇配制成70%（質量體積分數）的待測溶液，攪拌，靜置24h待醇沉后過濾，將上清液濃縮至25.00mL，測定其葛根黃酮含量和透光率，計算黃酮轉移率。

取葛根提取液25.00mL，在殼聚糖澄清工藝優化后得出的最佳條件下澄清，靜置24h后過濾，取上清液測定葛根黃酮的含量及透光率，計算黃酮轉移率。

圖1 黃酮濃度對吸光度的標準曲線Fig.1 Standard curve of concentration of flavonoid and the absorbance

2 結果與分析

2.1 葛根溶液黃酮含量的測定

采用分光光度法在250nm波長處測定吸光度，其線性關系見圖1。以黃酮濃度（C）對吸光度（A）進行線性回歸，得回歸方程：A=0.0777C+0.0243（相關系數R2=0.999），即為提取液黃酮含量測定標準曲線。由圖1可知，黃酮濃度在4.00～11.0μg/mL范圍內其濃度值與吸光度具有良好的線性關系。

2.2 澄清前葛根提取液黃酮含量和透光率的測定

用紫外分光光度法測得澄清葛根提取液的透光率為24.7%，吸光度為0.671，換算得澄清前葛根提取液黃酮含量為416.2μg/mL。

2.3 單因素實驗

2.3.1 殼聚糖用量對透光率和黃酮轉移率的影響 如圖2所示，隨著殼聚糖用量的增加，葛根提取液的黃酮轉移率逐漸降低，透光率逐漸增大。說明隨著殼聚糖用量的增加，葛根提取液澄清度逐漸升高，而葛根提取液有效成分卻逐漸減少。在0.16～0.24g/100mL時，隨著殼聚糖用量的增高，透光率升高不太明顯，而黃酮轉移率卻大幅度降低，所以0.16g/100mL為最佳用量。當殼聚糖用量大于0.16g/100mL時，葛根提取液的澄清效果較好，而葛根黃酮轉移率卻降低。可能的原因是：隨著殼聚糖用量的增加，吸附架橋和電中和作用增強，澄清效果逐漸增強，另外殼聚糖可能會影響提取液中黃酮的穩定性，與蛋白質、鞣酸等大分子物質同時沉降，導致黃酮的含量呈飽和性而降低。酮的轉移影響較大。當pH為4時，有效成分黃酮的轉移率較高，大于70%；綜合考慮澄清效果，此pH條件下澄清后的提取液透光率也較高，即可選為較合適的pH。可能的原因是隨著pH降低，蛋白質和鞣質等大分子也帶正電荷，使殼聚糖的陽離子型澄清作用逐漸減弱，澄清效果變差。

圖2 殼聚糖用量對透光率和黃酮轉移率的影響Fig.2 Effect of amount of chitosan on the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.3.2 提取液pH與透光率及黃酮轉移率的關系 由圖3可知，隨著pH的增加，葛根黃酮的轉移率先下降后上升，而透光率一直呈上升趨勢。說明pH對葛根黃

圖3 提取液pH與透光率和黃酮轉移率的關系Fig.3 Relationship of pH of extracting solution with the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.3.3 提取液溫度對透光率及黃酮轉移率的影響 如圖4所示，在提取液溫度為30～50℃范圍內，隨著提取液溫度的升高，黃酮轉移率及透光率均呈上升趨勢；而在50～70℃范圍內，隨著提取液溫度的升高，黃酮轉移率及透光率均呈下降趨勢。說明提取液溫度為50℃時，葛根澄清度和黃酮轉移率最佳。隨著溫度的升高，澄清效果有所改善，但溫度過高會出現澄清效果變差的現象，且黃酮含量也逐漸減低。原因可能是高溫使溶液黏性降低，粒子熱運動加強，從而使架橋澄清作用減弱。

圖4 提取液溫度對透光率和黃酮轉移率的影響Fig.4 Effect of temperature of extracting solution on the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.4 殼聚糖澄清工藝的優化

正交實驗結果見表2，用殼聚糖澄清葛根提取液過程中，考慮到黃酮轉移率和提取液透光率是研究殼聚糖澄清效果的兩個指標，在盡可能保持較高黃酮轉移率的條件下，透光率越大越好。所以對黃酮轉移率和透光率這兩個指標分別賦予權重，再進一步進行極差分析，結果見表3。賦予黃酮轉移率和透光率的權重分別為0.8和0.2，在這個基礎上再進行極差分析，從而獲得最佳的澄清工藝條件。

表2 L9（34）正交實驗結果Table 2 L9（34）Design and results of orthogonal experiment

從表3中可以看出，影響殼聚糖澄清葛根提取液的效果的因素主次順序是C＞B＞A，即提取液溫度對澄清效果的影響最大，其次是提取液的pH，最后為殼聚糖用量，確定的最優方案為A2B3C3。由正交實驗可得最佳工藝條件為：殼聚糖用量是0.16g/100mL，pH是5.5，提取液溫度是60℃。在此條件下進行驗證實驗，得出黃酮轉移率為73.25%，葛根澄清液透光率為97.9%。殼聚糖澄清葛根提取液的工藝簡單且澄清效果很好，對葛根的有效成分也有較好的保留作用。

表3 極差分析Table 3 Range analysis

2.5 殼聚糖分子量與葛根提取液透光率和黃酮轉移率的關系

如表4所示，同一澄清工藝條件，不同分子量殼聚糖對葛根提取液的澄清效果差別較大。當殼聚糖分子量為400ku時，澄清效果最好，透光率高達97.9%，而當分子量為700ku時，澄清液較混濁，透光率只有81.4%，而選用分子量為3～5ku的殼聚糖時，澄清效果較差且黏糊難以過濾，但葛根黃酮轉移率較高。因此上述討論的殼聚糖最優澄清工藝只適用于質量分數為400ku的殼聚糖。

表4 最優條件下不同分子量殼聚糖的澄清效果比較Table 4 Comparison of the clarification effect by chitosan with different molecular weight on the optimal conditions

2.6 殼聚糖澄清法與醇沉法的比較

表5為葛根提取液經澄清法與醇沉法過濾后的黃酮轉移率及透光率。由表5可得，醇沉法澄清葛根提取液的黃酮轉移率較高，高達89.72%，而澄清度比殼聚糖澄清時差，透光率只有82.3%。殼聚糖（分子量為400ku）澄清效果與醇沉效果相比，殼聚糖澄清效果較好，而葛根黃酮的轉移率相對偏低。

表5 最優條件下殼聚糖澄清法與醇沉法的澄清效果比較Table 5 Comparison of the clarification effect by chitosan and alcohol on the optimal conditions

3 結論

實驗以葛根黃酮轉移率、提取液透光率為指標，通過單因素實驗和正交實驗對澄清工藝進行優化，得出最佳工藝條件即殼聚糖用量是0.16g/100mL，提取液pH為5.5，提取液溫度是60℃時，澄清效果最好。在此條件下黃酮轉移率為73.25%，葛根澄清液透光率高達97.9%。殼聚糖澄清葛根提取液的工藝簡單，成本低廉，且澄清效果很好，葛根的有效成分也能得到較大程度的保留，本實驗結論可為工業化應用提供參考。

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Optimization of clarification process of extracting solution from Radix Puerariae with chitosan

WU Zhan-xia1，YANG Xi-hong2，*，LI Si-dong1，LIU Li-li1，CHEN Xiao-qi1
（1.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The optimum condition of clarification process of extracting solution from Radix Puerariae with chitosan was investigated using single factor experiment and orthogonal experiment with the transport rate of flavonoid and the light transmittance of extracting solution as indexes.The optimum conditions of flocculation were as follows：the clarification temperature was 60℃，the amount of chitosan with molecular weight of 400ku was 0.16g/100mL（the content of chitosan per 100mL of extracting solution from Radix Puerariae）and the pH value was 5.5.Under this condition，the transport rate of flavonoid was 73.25%，and the light transmittance was 97.9%.The clarification technology by chitosan had good effect on the extracting solution from Radix Puerariae，in addition，the effective component of Radix Puerariae was well preserved.

extracting solution from Radix Puerariae；chitosan；flavonoid；clarification

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0268-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.051

2013－10－12 *通訊聯系人

吳湛霞（1967-），女，大專，實驗師，研究方向：海洋應用化學。

國家自然科學基金項目（31271938）。