響應面法優化Ca2+激活牦牛血中凝血酶原工藝研究

張 陽，張 珍，*，張盛貴，牛黎莉，杜 雨，周 蕓（.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；.甘肅省華池縣質量技術監督局，甘肅慶陽745600）

響應面法優化Ca2+激活牦牛血中凝血酶原工藝研究

張 陽1，張 珍1，*，張盛貴1，牛黎莉1，杜 雨1，周 蕓2
（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省華池縣質量技術監督局，甘肅慶陽745600）

以牦牛血液為原料，采用檸檬酸鋇吸附法制取凝血酶原。選取激活溫度，Ca2+終濃度，激活時間三個因素，在單因素實驗基礎上進行Box-Behnken中心組合實驗，研究了Ca2+激活牦牛血中凝血酶原的工藝條件，實驗結果表明：激活溫度27℃、Ca2+終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h，在此條件下凝血酶的比活力最優為63.3972U/mg。

Ca2+激活，凝血酶原，牦牛，檸檬酸鋇吸附，響應面實驗

凝血酶（Thrombin Ec 3.4.21.5）是血液凝固系統中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶，是凝血酶原經凝血酶原激活物激活而成的，具有較高的專一性，它能夠促使血液中的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，同時促使血小板聚集，加速血液凝固，從而達到迅速止血的目的。凝血酶的活性前體物質是凝血酶原，其本身沒有活性，不能將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，只有將其激活成凝血酶才有應用價值，生理條件下，凝血酶原由凝血因子V、Xa、Ca2+和磷脂共同激活生成凝血酶[1]。實際應用中激活的方式有多種：a.用促凝血酶和氯化鈣激活凝血酶原，促凝血酶可由兔腦、人體組織或人體重組器官以及牛腦中獲得[2]；b.用蛇毒激活[3]；c.單獨使用Ca2+激活[4-5]。

目前，國內主要從動物血漿中提取凝血酶[6-8]，但尚未有從牦牛血中提取凝血酶的報道。我國是牦牛主產國，占世界牦牛總數的92%以上，其主要分布于青海、西藏、四川、甘肅、新疆、云南等六省區的高寒草原區[9]。牦牛血中含有豐富的營養成分和一些藥用價值很高的酶類，其中就有凝血酶。對牦牛血液的利用，除有報道的從牦牛血液中提取免疫球蛋白IgG[10]、SOD[11]和少量食用外，大量血液遭到丟棄，造成了極大的資源浪費和環境污染。因此，從牦牛血中提取凝血酶，既可以充分利用牦牛血資源，提高牦牛血的附加值，又可以減少因污血排放造成的環境污染，具有重大社會意義。鑒于此，本實驗以檸檬酸鋇吸附法制取凝血酶原，采用Ca2+激活牦牛血中凝血酶原，通過實驗，探索激活牦牛血中凝血酶原的最優工藝，以期為屠宰行業大量污染環境的牦牛血資源能得到充分利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牦牛血 取自甘肅夏河；凝血酶標準品、纖維蛋白原標準品、牛血清白蛋白標準品 中國藥品生物制品檢定所；透析袋 美國進口；考馬斯亮藍G-250、乙醇、磷酸、鹽酸、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鈉、氯化鈣、氯化鋇、檸檬酸鈉及其他試劑 均為分析純。

高速冷凍離心機（H-1850R） 長沙湘儀離心機儀器有限公司；紫外分光光度計（UV722S） 北京普析通用儀器有限責公司；分析天枰（FA2004） 上海越平科學儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-S24）

上海一恒科學儀器有限公司；數字酸度計（PHS-3C） 成都世紀方舟科技有限公司；磁力攪拌器（CJJ78-1） 金壇市大地自動化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質含量測定 蛋白質含量測定采用Bradford法[12]。

1.2.2 凝血酶活力測定 凝血酶活性測定采用中國藥典介紹的方法[13]。

1.2.3 檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原 原理：檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入BaCl2產生檸檬酸鋇沉淀，凝血酶原等依賴于維生素K的凝血因子被吸附在檸檬酸鋇上，隨之沉淀分離出來，沉淀用EDTA解吸，棄去沉淀，上清液經Tris-HCl透析后即得凝血酶原。

操作步驟：新鮮牦牛血，加入1/10原血液體積濃度為3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，-20℃下冷凍3d，4℃解凍后，于3500r/min離心10min，得血漿[14]。取血漿50mL，邊攪拌邊緩慢加入6mL 1mol/L的BaCl2溶液，磁力攪拌1h后4000r/min轉速下離心15min，收集檸檬酸鋇沉淀，將沉淀溶于等血漿體積pH8.0 0.2mol/L的EDTA溶液中，攪拌1h，4000r/min離心15min棄去不溶物，上清液用0.05mol/L pH7.2的Tris-HCl緩沖液透析，不斷更換透析液，至無Ba2+為止[15]，得凝血酶原液。

1.2.4 凝血酶原的激活 凝血酶原液中加入CaCl2溶液，使其達一定濃度，在一定溫度下激活一段時間，得凝血酶。

1.2.5 凝血酶原激活工藝單因素實驗設計

1.2.5.1 激活溫度對凝血酶活力的影響 在Ca2+終濃度0.01mol/L，激活時間2h時，討論激活溫度對凝血酶活力的影響。溫度設定為5、15、25、35、45℃，重復三次。

1.2.5.2 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響 在最適激活溫度，激活時間2h時，討論Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響。Ca2+終濃度設定為0.005、0.01、0.015、0.020、0.025mol/L，重復三次。

1.2.5.3 激活時間對凝血酶活力的影響 在最適Ca2+終濃度，最適激活溫度時，討論激活時間對凝血酶活力的影響。時間設定為1、2、3、4、5h，重復三次。

1.2.6 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，以激活溫度（℃）、Ca2+終濃度（mol/L）和激活時間（h）為自變量（Xi），凝血酶比活力為響應值（Y），運用Box-Behnken模型設計三因素三水平二次回歸方程，擬合自變量與凝血酶比活力之間的函數關系。實驗因素水平見表1。

表1 響應面設計因素水平Table 1 Independent variables and their corresponding levels in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素對凝血酶活力的影響

2.1.1 激活溫度對凝血酶活力的影響 由圖1可知，凝血酶活力隨激活溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。激活溫度25℃時，凝血酶的活力達到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當激活溫度小于25℃，凝血酶的活力較低，這是由于凝血酶的活性中心結構受溫度的影響[16]，在溫度較低時，凝血酶的活性中心沒有被完全激活，使得凝血酶的活力較低。當激活溫度大于25℃，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活性逐漸降低，這是由于高溫破壞了其活性中心結構而導致部分酶活性喪失。因此，選擇25℃為最佳激活溫度。

圖1 激活溫度對凝血酶活力的影響Fig.1 Effect of activating temperature on the activity of thrombin

2.1.2 激活時間對凝血酶活力的影響 由圖2可知，凝血酶活力隨激活時間的增加呈先增大后減小的趨勢。激活時間2h時，凝血酶活力達到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當激活時間小于2h，凝血酶活力較低，這可能是由于凝血酶沒有被完全激活。當激活時間大于2h，隨著激活時間的不斷延長，凝血酶的活力逐漸降低，這可能與環境因素有關，說明牦牛凝血酶不穩定，放置時間越長其酶活損失越多。因此，選擇2h為最佳激活時間。

圖2 激活時間對凝血酶活力的影響Fig.2 Effect of activating time on the activity of thrombin

2.1.3 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響 由圖3可知，凝血酶活力隨Ca2+終濃度的增加呈先增大后減小的趨勢。Ca2+終濃度為0.01mol/L時，凝血酶的活力達到最大，并與其他水平有顯著性差異（p＜0.05）。當Ca2+終濃度小于0.01mol/L，凝血酶的活力較低，這是由于Ca2+是凝血酶的輔基[16]，在Ca2+終濃度小于0.01mol/L時，凝血酶的活性中心不能被Ca2+完全激活，從而使得凝血酶的活力較低。當Ca2+終濃度大于0.01mol/L，隨著Ca2+終濃度的不斷增大，凝血酶的活力逐漸降低，這是由于過多的Ca2+破壞了凝血酶的空間結構，從而使得部分凝血酶活性喪失。因此，選擇0.01mol/L為最佳Ca2+終濃度。

圖3 Ca2+終濃度對凝血酶活力的影響Fig.3 Effect of final concentration of Ca2+on the activity of thrombin

2.2 響應面實驗結果及模型的建立

在單因素實驗的基礎上，利用響應面法確定牦牛凝血酶原最佳激活工藝，實驗結果見表2。利用Design Expert軟件對表2實驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸模型：Y=63.48+1.04X1-0.22X2+0.27X3+ 0.33X1X2-1.51X1X3+0.77X2X3-3.01X12-1.36X22-0.59X32。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 The result and condition of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

由回歸模型方差分析（表3）可以看出：模型p＜0.0001，模型極顯著；失擬項p=0.5413＞0.05，失擬項不顯著；決定系數（R2）為0.9881，校正系數（R2Adj）為0.9728，該模型能解釋97.28%響應值的變化，因而該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預測Ca2+激活牦牛凝血酶原的工藝結果。在總的作用因素中，回歸方程一次項X1、二次項X12、X22及交互項X1X3、X2X3對激活牦牛凝血酶原的影響均達極顯著水平。各因素對其的影響順序依次為激活溫度＞激活時間＞Ca2+終濃度。

2.3 響應面分析

圖4 Ca2+離子終濃度（B）與激活溫度（A）響應面圖Fig.4 Effect of final concentration of Ca2+（B）and activating temperature（A）on viscosity response surface

圖4 顯示了當激活時間為中心水平1.95h時，Ca2+離子終濃度和激活溫度對凝血酶活力的交互作用。當離子濃度不變時，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活力呈現先增大后減小的趨勢；當固定激活溫度不變時，凝血酶的活力隨著Ca2+離子終濃度的增大也呈現出先增大后減小的趨勢；Ca2+終濃度和激活溫度在0.075～0.0125mol/L、23～28℃之間時，凝血酶活力有最大值。

圖5 激活時間（C）與激活溫度（A）響應面圖Fig.5 Effect of activating time（C）and activating temperature（A）on viscosity response surface

圖5 顯示了當Ca2+離子終濃度為中心水平0.01mol/L時，激活時間和激活溫度對凝血酶活力的交互作用。當激活時間一定時，隨著激活溫度的升高，凝血酶的活力呈現出先增大后緩慢減小的趨勢；當固定激活溫度不變時，凝血酶的活力隨著激活時間的延長呈現出先增大后趨于平緩的趨勢；激活時間和激活溫度在1.5～2.5h、25～30℃之間時，凝血酶活力有最大值。

圖6 激活時間（C）與Ca2+離子終濃度（B）響應面圖Fig.6 Effect of activating time（C）and final concentration of Ca2+（B）on viscosity response surface

圖6 顯示了當激活溫度為中心水平27℃時，激活時間和Ca2+離子終濃度對凝血酶活力的交互作用。當激活時間不變時，隨著Ca2+離子終濃度的增大，凝血酶的活力呈現出先增大后減小的趨勢；當固定Ca2+離子終濃度不變時，凝血酶的活力隨著激活時間的延長也呈現出先增大后減小的趨勢；激活時間和Ca2+離子終濃度在1.5～2.5h、0.007～0.012mol/L之間時，凝血酶活力有最大值。

2.4 響應面工藝的驗證

本實驗優化得出激活牦牛凝血酶原的最佳工藝條件為：激活溫度26.82℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h，凝血酶活力的理論值為63.5811U/mg，考慮到實際操作的可行性，將凝血酶原的激活工藝優化為激活溫度27℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h。按上述條件進行驗證實驗，測定凝血酶的活力為63.3972U/mg，酶活與預測值之間的相對誤差為0.3%。證明應用響應面法優化的牦牛凝血酶原的激活工藝模型可行。

3 結論

通過Box-Behnken實驗設計，優化Ca2+離子激活牦牛血中凝血酶原的最佳工藝條件為：激活溫度27℃、Ca2+離子終濃度0.01mol/L、激活時間1.95h。在上述條件下，凝血酶活力的實驗值為63.3972U/mg，酶活與預測值之間的相對誤差為0.3%，各因素對凝血酶活力的影響依次為：激活溫度＞激活時間＞Ca2+終濃度。通過對回歸模型進行方差分析和交互作用分析，得知該回歸模型極顯著，對實驗擬合較好。因此，采用響應面法分析優化得到的參數具有一定的實用價值。

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Study on optimization of Ca2+on activation of prothrombin process conditions in yak blood by response surface method

ZHANG Yang1，ZHANG Zhen1，*，ZHANG Sheng-gui1，NIU Li-li1，DU Yu1，ZHOU Yun2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.The Quality&Technical Supervision Bureau Of Huachi，Qingyang 745600，China）

Yak blood as the research object，the prothrombin was prepared by adsorption method with barium citrate.The study optimized preparation conditions of Ca2+activating the prothrombin in yak blood by single factor experiment（the activating temperature，final concentration of Ca2+and activating time）and Box-Behnken experiment.The results showed that the optimal thrombin specific activity was 63.3972U/mg at the following conditions：activating temperature 27℃，final concentration of Ca2+0.01mol/L，activating time 1.95h.

activating by Ca2+；prothrombin；yak；adsorption with barium citrate；response surface experiments

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0293-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.056

2013－10－23 *通訊聯系人

張陽（1987-），男，碩士研究生，研究方向：營養與食品衛生學。

國家科技部支撐計劃項目（2007BAD52B07）；甘肅省科技廳自然基金（1107RGZA123）。