四角蛤蜊醇沉上清液對CCl4致小鼠急性肝損傷保護作用

陸杰霖，劉秋風，賈夢蛟，柴　堯，劉　睿，王欣之，吳　皓（南京中醫藥大學江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發重點實驗室，江蘇南京210023）

四角蛤蜊醇沉上清液對CCl4致小鼠急性肝損傷保護作用

陸杰霖，劉秋風，賈夢蛟，柴堯，劉睿，王欣之，吳皓*
（南京中醫藥大學江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發重點實驗室，江蘇南京210023）

目的：研究四角蛤蜊醇沉上清液對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法：四氯化碳造成急性肝損傷模型，測定小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST），還原性谷胱甘肽（GSH）活性；測定肝勻漿中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，對肝組織進行病理學檢查。結果：醇沉上清液（MS）高、中、低劑量組具有明顯的劑量依賴性降低CCl4致小鼠肝損傷血清ALT，AST，GSH（p＜0.01），高、中劑量組降低肝勻漿中MDA的含量（p＜0.05），增強SOD的活性（p＜0.01）。通過病理學切片觀察，MS各劑量組能顯著改善肝組織的病理變化。結論：MS對CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用。

四角蛤蜊醇沉上清液，四氧化碳，保肝作用

四角蛤蜊（Mactra venerformis）為軟體動物門（Mollusca），隸屬于瓣鰓綱（Lamellibranchia）異齒亞綱（Helterodonta）簾蛤目（Veneroida）蛤蜊科（Mactride）的動物，是一種分布于我國南北各海區較大型的經濟貝類[1]?，F代研究表明，四角蛤蜊具有較好的抗氧化活性，其活性較強部位在四角蛤蜊的水提醇沉上清液中[2]。課題組前期研究表明，四角蛤蜊醇沉上清液經分析測定，含有核苷類[3]占上清液中總量為2%左右、總氨基酸占上清液中30%左右，上清液中還含有脂肪酸類及甾醇類等小分子。本文以腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠急性肝損傷模型，評價四角蛤蜊水提醇沉上清液的保肝活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

四角蛤蜊江蘇省海洋水產研究所提供，批號：20100706，經江蘇省海洋水產研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科動物四角蛤蜊（Mactra veneriformisReeve）的新鮮軟體部分；ICR小鼠18～22g，雄性，清潔級，南京醫科大學實驗動物中心提供，動物生成許可證SCXK（蘇）2008-0004；聯苯雙脂北京協和藥廠，產品批號：12060105；四氯化碳成都市科龍化工試劑廠，批號：20120220，使用時用花生油配制成0.1%的花生油溶液，現配先用；氯化鈉注射液南京小營藥業集團有限公司，批號：12012110606；BCA蛋白測試盒、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供。

YP6002型電子天平上海光正醫療儀器有限公司；3-16PK型臺式高速冷凍離心機Sigma；XHF-P型高速分散器內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；80-2B型臺式離心機上海安亭科學儀器廠制造；RT-6000型酶標儀美國雷杜；HH-4數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；Waters 2695液相色譜儀美國Waters公司；BP211D型電子分析天平德國Satrorius公司；KQ-250型超聲清洗器昆山超聲儀器有限公司；純水機美國Millipore公司；FA1104型電子分析天平上海精密科學儀器有限公司。

1.2樣品制備

取新鮮四角蛤蜊軟體15kg，洗凈泥沙，瀝干后絞碎，放入多功能提取罐，加3倍量水，每次煮沸40min，煎煮3次，除去濾渣，合并濾液，得到四角蛤蜊總提液。將濾液濃縮至適量，14000r/min離心，取上清液，加入95%乙醇，使乙醇質量分數達到65%，攪勻，靜置24h，抽濾，得沉淀和上清液。將沉淀用適量水復溶后加95%乙醇，使乙醇質量分數達75%，攪勻，靜置24h，合并兩次上清，加壓回收乙醇，得褐色的上清液浸膏，即得四角蛤蜊醇沉上清液（MS）。

1.3動物實驗

1.3.1動物分組和造模方法取60只小鼠，隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組，四氯化碳模型組，MS的低、中、高劑量組（250、500、1000mg/kg）及聯苯雙酯組（150mg/kg）。正常對照組和CCl4模型組給予等量的生理鹽水，給藥組連續灌胃7d，于末次給藥1h后，除正常組對照腹腔注射花生油20mL/kg外，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液20mL/kg。禁食（不禁水）16h后，所有小鼠眼眶放血取血后，分離血清，測定血清中ALT、AST及GSH的活性。取血后小鼠立即解剖，取一小塊肝組織，均取相同部位，用4%左右的福爾馬林溶液固定，進行石蠟包埋切片。同時另取相同部位的一塊肝組織用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，低溫離心后去上清液，用硫代巴比妥酸法測定肝勻漿上清液中MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定勻漿上清液中SOD活力。

1.3.2生化指標檢測賴氏法測定血清中ALT，AST活性，二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法測定GSH，硫代巴比妥酸法測定肝勻漿上清液中MDA含量，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法測定肝勻漿上清液中的蛋白含量，黃嘌呤氧化酶法測定勻漿上清液中SOD活力。

1.3.3病理學檢查用4%左右的福爾馬林溶液固定肝組織，常規石蠟包埋切片（片厚4μm），進行HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化，檢查下列指標：a.有無肝細胞脂變、水腫；b.有無肝細胞壞死；c.肝小葉內有無炎細胞浸潤；d.門管區有無炎癥及纖維組織增生。

1.4數據處理

2　結果與分析

2.1MS對急性肝損傷小鼠血清生化指標的影響

CCl4模型組血清中ALT、AST、GSH的含量與正常對照組相比，均明顯升高（p＜0.01），見表1，說明本次實驗動物模型造模成功。MS的低、中、高劑量組及陽性藥對照組組血清ALT、AST、GSH活性與模型組相比具有顯著性差異（p＜0.01），給藥組呈劑量依賴性。其中，高劑量組其保肝活性與陽性對照藥聯苯雙酯接近。

本實驗結果顯示，CCl4誘導小鼠肝細胞損傷，從形態學及血清中ALT、AST活性測定顯示，損傷組與空白對照組相比明顯升高，而經過預期給藥四角蛤蜊醇沉上清液7d的給藥組血清中ALT、AST明顯下降（p＜0.01），且呈一定的劑量依賴性，證實四角蛤蜊醇沉上清液能減輕CCl4所致急性肝損傷。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的天然小分子三肽，作為體內的中藥保護因子，對保護生物膜及生物大分子免受自由基損傷起著極其重要的作用[4]，保護損傷的細胞。本實驗中，模型損傷組GSH顯著的升高，而預防性給予四角蛤蜊醇沉上清液的給藥組，GSH均顯著性的降低，且如同ALT、AST一樣，呈劑量依賴性。

2.2MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿上清液中MDA含量、SOD活性的影響

CCl4模型組小鼠肝勻漿上清液MDA含量顯著升高（p＜0.01），SOD活性顯著降低（p＜0.01），MS對MDA有較強的抑制作用，能提高SOD的活性。其中，MS的中、高劑量組與聯苯雙脂組肝勻漿上清液中的MDA含量及SOD活性與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05）。自由基是啟動脂質過氧化的關鍵性的因素，當自由基含量越高時，說明肝臟的損傷程度也是越嚴重的，SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可以抑制自由基啟動的脂質過氧化；MDA會導致細胞膜結構、功能和代謝發生改變，能使膜通透性增加，對機體造成損傷[5]。本實驗表明，MS中、高劑量組可以顯著降低CCl4致急性肝損傷小鼠肝勻漿上清液中MDA含量的升高（p＜0.05），提高SOD的活性（p＜0.01），提示了四角蛤蜊醇沉上清液對肝臟的保護作用也許是通過抗自由基及抑制脂質過氧化而發揮作用的。

表1　MS對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1　Effect of MS on ALT,AST by liver damaged（±s，n=8）

表1　MS對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1　Effect of MS on ALT,AST by liver damaged（±s，n=8）

注：與模型組相比，*：p<0.05，**：p<0.01；表2同。

組別　劑量（mg·kg-1）　ALT（U·L-1）　AST（U·L-1）　GSH（μmol·gprot-1）正常對照?。?4.87±10.38**　28.76±5.84**　67.83±22.81**模型組?。?51.72±20.35　59.10±4.44　98.48±18.36聯苯雙脂組　150　51.61±23.50**　27.60±3.96**　67.17±8.41**MS組250　85.36±29.97**　32.91±4.07**　69.35±11.25**500　71.54±26.58**　28.58±4,47**　64.78±14.81**1000　54.79±22.67**　27.10±3.52**　61.96±11.08**

表2　MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA，SOD的影響（±s，n=8）Table 2　Effect of MS on MDA,SOD and liver index by liver damaged（±s，n=8）

表2　MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA，SOD的影響（±s，n=8）Table 2　Effect of MS on MDA,SOD and liver index by liver damaged（±s，n=8）

SOD（U·mg prot-1）正常對照　－　2.79±0.58**　29.67±2.50**模型組　－　4.17±1.16　26.24±2.61聯苯雙脂組　150　2.91±0.60*　29.91±2.58*組別　劑量（mg·kg-1）MDA（nmol·mg prot-1）MS組250　3.90±1.05　41.72±2.87**500　2.83±0.59*　44.37±3.40**1000　2.69±0.60*　52.00±3.70**

2.3MS對急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響

病理切片結果表明，正常對照組小鼠肝臟肝小葉略呈六邊形，結構清晰，肝細胞無變形、壞死，門管區無炎癥或纖維組織增生，小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管無病變。本組每例小鼠的肝臟各個部位均未見明顯病變。CCl4模型組小鼠主要為氣球樣變，變形的肝細胞體積明顯增大，胞漿疏松、淡染，核結構欠清，集聚成灶狀分布，氣球樣變的肝細胞灶內或周圍少數肝細胞嗜酸性壞死，肝小葉和門管區見中度炎細胞浸潤。MS低劑量組病變程度明顯輕于模型組，與高劑量、中劑量組比較，病變略明顯，肝細胞未見明顯水腫、脂變或氣球樣變，4例小鼠有輕微或輕度嗜酸變性，變性的肝細胞表現為細胞體積縮小，胞漿深伊紅染，細胞核變??；中劑量組肝細胞病變程度明顯輕于模型組，病變程度較高劑量組略明顯，肝細胞有輕微水腫及輕微炎細胞浸潤；高劑量組肝細胞病變明顯輕于模型組，未見明顯變性，表明MS高劑量組在保護肝損傷作用方面最佳，見圖1。

3　結論

通過現代藥理研究手段初步證實了四角蛤蜊水提醇沉上清液具有保肝活性，符合了傳統中醫理論關于蛤蜊能解酒毒和潤五臟的認識。本文研究可以初步判定核苷、氨基酸類是四角蛤蜊起保肝活性的物質成分，為四角蛤蜊新藥或功能性產品的研發奠定了理論基礎。

Experimental study on ethanol subsiding method from Mactra veneriformis on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice

LU Jie-lin，LIU Qiu-feng，JIA Meng-jiao，CHAI Yao，LIU Rui，WANG Xin-zhi，WU Hao*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics，Nanjing 210023，China）

Objective：The effect of ethanol subsiding method from Mactra veneriformis（MS）was studied by carbon tetrachloride（CCl4）-induced liver injury in mice.Methods：Blood tissue samples were collection.Evaluations were made for lipid peroxidation，enzyme activities and biochemical parameters.Pathological histology was also performed.Results：MS pretreatment reduced the serum aspartate aminotransferase（ALT），alanine aminotransferase（AST），andreducedglutathioneactivities.Bycontrast，MSpretreatmentreduced liver MDA content and increased liver tissue SOD.The CCl4-induced histopathological changes were also reduced by the MS pretreatment.Conclusion：MS could be proposed to protect the liver damage induced by CCl4.

ethanol subsiding method from Mactra veneriformis；CCl4；hepatoproteaction

圖1　各組小鼠肝組織染色（HE，200×）Fig.1　Mouse livers pathological photograhps（HE，200×）

TS254.1

A

1002-0306（2014）14-0356-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.070

2013－11－11*通訊聯系人

陸杰霖（1989-），女，碩士研究生，研究方向：海洋藥物。

國家海洋公益性行業科研專項（201305007）；國家863計劃（SS2013AA090303）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（ysxk-2010）。