抗菌肽KS26基因的串聯及在畢赤酵母中的表達

張元新，葛雅琨

(吉林化工學院化工與生物技術學院，吉林吉林132022)

自青霉素誕生以來，抗生素一直是治療人類病原微生物感染疾病的重要武器;但是，隨著抗生素的濫用及致病菌的多藥耐藥性的產生，抗生素逐漸失去往日的作用效果，所以尋找新型的抗菌資源已成為備受關注的焦點［1］.陽離子抗菌肽是由12-50個氨基酸組成的陽離子型的兩親性分子.目前，已作為一種新型抗生素被廣泛研究，它們存在于動物、植物、微生物中，是細菌、植物、低等動物的主要防御機制［2］.在脊椎動物中，也能夠運用特殊的免疫方式，作為一線防御物質，在病原微生物侵入早期抑制其生長［3］.因此，陽離子抗菌肽因其具有的陽離子電荷和兩親構象使其具有良好的抗菌活性，備受科研工作者的重視［4］.

利用固相態化學合成小片段陽離子小分子多肽成本太高［5］.因此，利用畢赤酵母系統進行體外重組表達的方法能夠有效降低成本［6］.該系統具有很多優點［7］:(1)利用受甲醇誘導的醇氧化酶(alcohol oxidaseⅠ，AOX1)啟動子，可嚴格控制外源基因的表達;(2)畢赤酵母生長快速，培養簡單，適合高密度培養，發酵后每升培養液細胞濕重可達450克，有利于提高目的蛋白產量;(3)畢赤酵母作為一種真核細胞生物，可以進行蛋白翻譯后的加工，以使外源蛋白蛋白得到正確的折疊盒修飾;(4)該系統已有20多年的研究開發歷史，有多重受體菌和表達載體可供選擇，可以進行胞內表達和分泌表達.因此，利用畢赤酵母真核表達系統進行小肽的重組表達，將有效降低生產成本，保證小肽的正確構象，提升其活性.本研究利用SOE-PCR方法快速、高效的獲得了小分子多肽全基因，利用同尾酶得到基因串聯體，并將其構建到畢赤酵母表在載體pPICZα A上，成功誘導出小肽的蛋白產物，為小分子多肽的真核表達研究奠定實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌種

pPICZα A 真核表達質粒、DH5α、GS115感受態細胞為吉林化工學院生物技術研究室保存.

1.1.2 主要試劑與儀器

質粒小量提取試劑盒(BioTeke)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(BioTeke)，限制性內切酶XhoI、XbaI、SalI、SacⅠ(Takara)，低分子量蛋白 Marker(BioTeke)，T4 DNA 連接酶(Takara)，Taq DNA polymerase(Fermentas)，Zeocin(Invivogen)，Tricine(Sigma).PCR 儀(Bio-Rad)，電子分析天平(Sartorius)，電泳儀和電泳轉移槽(北京市六一儀器廠)，紫外可見透射反射儀(上海精科實業有限公司)，電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，振蕩培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)，凝膠成像系統(Bio-Rad).

1.2 方法

1.2.1 KS26 基因的設計

以畢赤酵母(Pichia pastoris)的偏愛密碼子、多肽氨基酸序列為基礎，設計基因全長78 bp.SOE-PCR的引物均用Primer 5輔助設計，克隆引物加入酶切位點XhoI、XbaI，在上下游引物的3，末端設計互補重疊序列，在反應體系中使兩引物互為模板進行PCR.

1.2.2 KS26 全基因的獲取

通過SOE-PCR的方法獲取KS26全基因(78 bp).PCR程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 個循環后72℃ 10 min結束反應.

反應體系:10 × PCR buffer 5 μl、MgCl23 μl、dNTP 1 μl、引物 F 1 μl、引物 R 1 μl、Taq1 μl、加ddH2O 至總體積 50 μl.

1.2.3 KS26 基因的串聯

以KS26基因為基礎，Primer 5輔助設計，分別在上游引物和下游引物加上同尾酶 Xho I、Sal I，引物見表1.酶切連接反應的緩沖液為:Tris-HCl(Ph 7.6)660 mmol/L、MgCl266 mmol/L、ATP 1 mmol/L、DTT 100 mmol/L、NaCl 1 mol/L.反應體系:10 × buffer 2 μl，新鮮的 PCR 產物 12 μl，Xho I 2 μl，Sal I 2 μl，T4 DNA Ligase 2 μl，總體積為20 μl.酶切連接反應條件:37℃酶切1 h;22℃連接1 h，10個循環后結束反應.

表1 KS26基因串聯引物*

1.2.4 重組載體 PICZα-KS26的構建

KS26基因的PCR產物和載體pPICZα A均用XhoI、XbaI雙酶切，將膠回收后的雙聯體KS26 PCR產物與載體pPICZα A在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜.連接產物轉化感受態E.coli DH5α，轉化平板(含 zeocin)37 ℃過夜培養.挑取單一菌落于10 μl無菌水中充分懸浮菌體，100℃裂解5 min，取1 μl作為模板進行 PCR驗證.將驗證陽性的單克隆接種于10～15 mL LB培養基(zeocin，終濃度為 100 μg/mL)，37 ℃，200 rpm培養過夜，質粒小提后，進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒交由上海生工生物工程有限公司測序部進行DNA測序.

1.2.5 pPICZα-KS26 轉化 P.pastoris GS115(hismut+)轉化子的篩選和鑒定

感受態 P.pastoris GS115(his-mut+)(80 μL)與 SacⅠ線性化的 pPICZα-小分子多肽(5 μg)混合，轉移至預冷的 0.2 cm電轉杯中，置冰上5 min，1.5 kV、25 μF、200 Ω 電擊 5 ms，立即加入1 mL預冷的1 mol/l山梨醇，取出200 μL涂布于MD板上，30℃培養2 d，通過比較轉化子在MM和MD板上的生長速度來篩選Mut+轉化子.

采用PCR方法分析P.pastoris轉化子，挑取平板上的菌體，加入5 μL無菌水中，煮沸5 min，加入重新設計的鑒定引物F-tcgactcgagatgaagaaggtttcc和 R-ctgacttctagagtcgactccattg，反應體系同上，進行PCR反應.

1.2.6 重組子 PICZα-KS26 在 P.pastoris菌在搖瓶中的誘導表達

挑取重組 P.pastoris，接種到 BMGY中，30℃、230 rpm/min振蕩培養約20 h至OD600達到2～6;室溫3000 rmp/min離心5 min，用BMMY(含1%Casaminoacids)重懸至 OD600約為1.0，30℃、250 rpm/min震蕩培養，進行甲醇誘導表達，每隔24 hr取樣，同時補加100%甲醇至終濃度為0.5%.

1.2.7 Tricine-SDS-PAGE

取5 μl表達上清液進行 Tricine-SDS-PAGE，凝膠采用硝酸銀染色，實驗步驟參照Hermann的方法.

2 結 果

2.1 KS26全基因的獲取及串聯體的構建

為了能使KS26在畢赤酵母系統中高效表達，我們按照畢赤酵母基因翻譯的偏愛密碼子設計合成F、R兩條互補引物，并使兩引物3’段的11個堿基互補，見表2.根據重疊PCR的原理，獲取了78 bp大小的PCR產物，見圖1A.

表2 KS26的氨基酸、基因和引物序列*

根據KS26全基因序列，我們重新設計了具有同尾酶Xho I、Sal I的上游和下游引物，并以SOE-PCR產物為模板，通過在PCR中重復完成酶切-連接的程序，成功獲得了具有Xho I、Sal I酶切位點的二聯體、三聯體產物，見圖1B.

圖1 SOE-PCR方法獲取的KS26全基因及其串聯體

2.2 重組載體pPICZα-KS26的構建

將KS26基因進行膠回收，其產物和載體pPICZα 均用 XhoI、XbaI雙酶切，用 T4 DNA Ligase連接，轉化感受態 E.coli DH5α菌，篩選陽性克隆.重組質粒經雙酶切鑒定并進行DNA測序，結果表明目的基因正確插入，DNA自動測序儀測序，序列如下:AAGAAGGTTTCCTTCAAGGTTAAGTTCAAGTCCGCTTGGGCTAAGACTGTTCATA CTGCTAAGCTGGCTCCTATTTCC.

2.3 篩選、鑒定Mut+轉化子

為了獲得更高的轉化效率和高拷貝，采用電轉化法將SacⅠ線性化的重組表達質粒pPICZα-KS26 轉化P.pastoris GS115(his-mut+)，通過MM和MD板鑒定表型，大約80%的為Mut+;PCR擴增結果顯示，陽性重組子出現了100 bp左右的插入目的片段，與預期相符，見圖2.

圖2 重組子的轉化及PCR鑒定結果(DNA標準同圖1)

2.4 Tricine-SDS-PAGE

抗菌肽KS26的分子量只有2.9 kD，在常規SDS-PAGE系統中難以得到理想的分辨率，我們使用Tricine-SDS-PAGE(16%分離膠，10% 濃縮膠，4% 濃縮膠，使重組小分子多肽得到較好的分離.Tricine-SDS-PAGE結果顯示:甲醇誘導表達上清在2.9 kD處出現一條帶，見圖3.

圖3 重組蛋白pPICZα-KS26的Tricine-SDS-PAGE電泳圖

3 結 論

抗菌肽不僅具有殺菌還具有抗病毒和抗腫瘤細胞而不破壞人體正常細胞的作用，因此在農業、畜牧業、醫藥及食品工業中顯示出越來越多的應用前景.陽離子抗菌肽水溶性好，且等電點在8.9～10.7之間，具有較強的陽離子特征，同時具有兩親α-螺旋和折β-疊片結構.陽離子抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，來自昆蟲、豬、蛙、人的陽離子抗菌肽既有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的作用，又有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的作用［7-9］.通常研制和應用的抗菌肽均是從昆蟲體液等天然物質中提取，來源途徑廣泛，但含量極低，提取步驟繁雜，很難獲得大量高純度的抗菌肽.目前陽離子抗菌肽的合成方法有化學合成和基因表達兩種.化學合成得到的樣品數量有限，而且差錯率和副反應隨著氨基酸數量的增多而增大，一般超過50個氨基酸的小肽很難合成.但陽離子抗菌肽結構簡單、氨基酸殘疾未被修飾，基因工程表達法是大量生產抗菌肽的理想方法［10］.本研究利用 SOE-PCR獲取抗菌肽KS26的全基因及其串聯體并構建了真核畢赤酵母表達系統，成功構建到進行了誘導表達，為快速、高效的進行小肽重組表達載體的構建、表達進行了有益的探索，有效地解決了小片段氨基酸合成成本過高的問題，將為短肽的規模化生產提供有效的實驗依據.

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