微波輔助提取北五味子多糖工藝研究

程振玉，楊英杰 ，劉治剛

(1.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130024;2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022)

北 五 味 子 ［Schisandra chinensis(Turcz.)Baill］作為一種滋補(bǔ)性、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、抗衰老的傳統(tǒng)中藥，廣泛應(yīng)用于我國和日本［1］.其主要活性成分五味子多糖，具有保肝、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、免疫促進(jìn)等重要作用［2-4］.而最常用的傳統(tǒng)的天然藥物提取方法耗時、耗溶劑，且提取率很低，嚴(yán)重阻礙了五味子藥用資

源的充分利用，因此高效率提取五味子多糖的新方法有待于急需開發(fā)，最近超聲波輔助法［5-7］、酶法［8］、

超臨界流體萃取等已被報道.據(jù)我們所知，微波輔助提取技術(shù)在北五味子多糖提取領(lǐng)域報道較少.

目前微波輔助提取技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于天然藥物研究領(lǐng)域［9-10］，該提取技術(shù)具有穿透力強(qiáng)、選擇性好、耗能少、加熱效率高、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn).本研究我們的目標(biāo)是充分探索微波與回流有機(jī)結(jié)合提取北五味子多糖的工藝條件，使多糖的提取率得到顯著提高，準(zhǔn)確分析北五味子中多糖的含量，為北五味子入藥評價和質(zhì)量控制提供更全面的分析工具和數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子藥材(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)購買于吉林省通化市，產(chǎn)地為長白山地區(qū)，清洗、晾干備用.

葡萄糖(天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號:20120728)，無水乙醇，苯酚，濃硫酸均為分析純.

微波合成/萃取儀XH-100A(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)，722可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)，離心機(jī) Allegra 64R(BACKMAN)，循環(huán)水式真空泵SHZ-D(河南省鞏義市英峪儀器一廠).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取

五味子粉碎，過不同孔徑的篩子，于60℃烘干后精確稱量10.0 g，放入圓底燒瓶，加入一定量的蒸餾水，以一定功率的微波在恒溫下輻射一段時間，完成萃取.然后用傳統(tǒng)回流水提的方法，將該燒瓶置于100℃下加熱回流提取2 h.提取液經(jīng)4 000 r/min離心15 min、去沉淀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的五分之一，加入無水乙醇至80%(v/v)，沉淀，靜置過夜，沉淀物經(jīng)真空干燥得到五味子粗多糖.

1.2.2 多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱量105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品100.00 mg，加蒸餾水溶解、搖勻，定容到100 mL，制成1.00 mg/mL貯備液，取出25 mL上述貯備液置于250 mL容量瓶中，制成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液［11-12］.

分別精密量取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25、30、35 mL，置于 7 個 50 mL 容量瓶中，加蒸餾水搖勻定容.分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置于7個25 mL的帶塞比色管，加入新制5%的苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，充分搖勻，另取1 mL蒸餾水做空白對照.于恒溫25℃放置30 min，在490 nm下用722可見分光光度記測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度mg/mL為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3 換算因子的測定

精確稱量精制干燥的五味子多糖50 mg，蒸餾水溶解后定容到100 mL，制成0.50 mg/mL溶液，取出4 mL上述溶液置于25 mL容量瓶中，制成80 μg/mL的多糖貯備液.精確量取1 mL，按照測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值［4，13-15］.

按下式計(jì)算換算因子:f=W/CD式子中W:多糖質(zhì)量(mg);D:多糖的稀釋因子;C:多糖溶液中葡萄糖的濃度(mg/mL)

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素基礎(chǔ)之上，選用L16(44)正交表［16］，對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定五味子中可溶性多糖提取的最佳工藝參數(shù)，擬定因素與水平，見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重的40目五味子，在微波的最佳工藝條件提取，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與換算因子

實(shí)驗(yàn)制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線和直線方程，見圖1.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微波輔助萃取多糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 微波輔助萃取時間的選擇

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重粒徑為80目的北五味子10.0 g，加入300 mL蒸餾水，于100℃以700 W 的功率微波分別萃取 5、10、15、20、25、30、35、40 min，用傳統(tǒng)加熱水提的方法，在100℃下回流提取2 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

回歸分析表明，在0.01～0.07 mg/mL范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好，葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)測得換算因子f=1.76.

圖2 處理時間對提取率的影響

2.2.2 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重粒徑為80目的北五味子 10.0 g，分別加入 50、100、200、300、400、500 mL蒸餾水，在100℃下以700 W的微波功率萃取25 min，用傳統(tǒng)加熱水提的方法，在100℃下回流提取2 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 料液比對提取率的影響

2.2.3 溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重粒徑為80目的北五味子10.0 g，加入200 mL蒸餾水，分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃ 下以 700 W 的功率微波輔助萃取25 min，然后用傳統(tǒng)加熱水提的方法，在100℃下回流提取2 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

圖4 溫度對提取率的影響

2.2.4 微波功率的選擇

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重粒徑為80目的北五味子10.0 g，加入200 mL蒸餾水，于100℃分別以 400、500、600、700、800、900、1000 W 的功率微波輔助萃取25 min，然后用傳統(tǒng)加熱水提的方法，在100℃下回流提取2 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.

圖5 溫度對提取率的影響

2.2.5 藥材粒徑的選擇

圖6 藥材粒徑對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重粒徑分別為20、40、60、80、100、120 目的北五味子 10.0 g ，加入200 mL蒸餾水，于100℃以800 W的功率微波輔助萃取25 min，然后用傳統(tǒng)加熱水提的方法，在100℃下回流提取2 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示.時提取率逐漸升高，25 min后，提取率增幅趨緩且逐漸降低，這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r電磁波把能量直接傳入分子內(nèi)部，使之瞬時加熱，因此在短時間內(nèi)對細(xì)胞膜的破碎作用較大，溶出物較多，所以提取率上升較快.但當(dāng)達(dá)到飽和時，有效成分不再被溶解，而且還有可能引起多糖的降解，因此提取率也就不再提高，故選擇15～30 min進(jìn)行工藝優(yōu)化.

由圖3可以看出，隨著料液比逐漸增大多糖含量增加，但當(dāng)料液比超過130時，五味子多糖提取量逐漸下降后趨于平緩.原因是溶劑體積較小時多糖尚未溶出便達(dá)到溶解平衡，致使產(chǎn)率較低，隨著溶劑的增加，多糖的溶出量增加.但溶劑過多，雜質(zhì)的析出也會增多，抑制目標(biāo)成分多糖的析出，因此選擇料液比1 15～1 30進(jìn)行工藝優(yōu)化.

由圖4可知，隨著溫度的升高，五味子多糖的提取率急劇增加.100℃的含量幾乎是70℃的2倍.這是因?yàn)檩^高的溫度一方面有利于植物細(xì)胞壁軟化，利于破壞組織結(jié)構(gòu)，使有效物質(zhì)溶出，另一方面可增加提取分子的動能，加快分子的運(yùn)動，加快擴(kuò)散，強(qiáng)化傳質(zhì)效果.故選擇70～100℃進(jìn)行工藝優(yōu)化.

由圖5可以看出，多糖在800 W之前隨著功率的增加而提高，大于800 W以后則降低，這可能是由于輻射功率越高，物系吸收微波能越多，分子運(yùn)動加快，固液傳質(zhì)速度亦加快，從而有利于多糖的溶出.然而繼續(xù)增加功率則使提取率降低，可能是因?yàn)槲⒉üβ试黾拥揭欢ǔ潭葧r，有可能促使多糖鏈斷裂，從而提取率下降，因此選擇700～1 000 W進(jìn)行工藝優(yōu)化.

由圖6可以看出顆粒過小或過大，提取率均呈下降趨勢.因?yàn)樘崛“B透、溶解、擴(kuò)散三個過程，物料過細(xì)，表面積太大，吸附作用增強(qiáng)，同時，大量細(xì)胞破裂致使細(xì)胞內(nèi)大量高分子物質(zhì)溶入外液，使外部藥液粘度增大，影響擴(kuò)散速率.從整體來看，粒徑對多糖提取率影響很不明顯，40目效果較好，因此本研究選擇40目為最佳粒徑.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果

微波正交試驗(yàn)結(jié)果，見表2.

由圖2可以看出，隨著提取時間的延長，開始

表2 微波正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 正交試驗(yàn)方差分析

根據(jù)正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果表2，以因素B作為基準(zhǔn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.

表3 方差分析

由表3可知，在影響北五味子多糖提取率的3個因素中，溫度(A)對五味子多糖得率有顯著性影響，微波功率(B)和料液比(C)影響較小，3個因素因數(shù)的影響順序依次為:溫度(A)＞微波功率(C)＞料液比(D).由此可以得出:微波輔助萃取北五味子多糖的最佳工藝條件是A4B3C3D1，即料液比為1 15，功率為900 W，提取時間為25 min，提取溫度為100℃.

2.4 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取60℃干燥至恒重的40目五味子，在優(yōu)化的工藝條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果.五味子多糖提取率為20.08%.

2.5 微波提取與回流提取的比較

回流法:按照文獻(xiàn)［17］方法，稱取40目的北五味子粉末10.0 g，加入250 mL蒸餾水，100℃提取4 h，測得多糖得率14.27%.微波法:稱取40目的北五味子粉末10.0 g，加入150 mL蒸餾水，以900 W的輻射功率于100℃提取25 min，測得多糖得率為11.43%.微波-回流結(jié)合法:稱取40目北五味子粉末10.0 g，加入150 mL蒸餾水，先以900 W的輻射功率于100℃提取25 min，然后在100℃中水浴回流提取2 h，提取率達(dá)到20.08%，比回流提取率增加了約40%，比微波增加了約75%.

3 結(jié) 論

通過系統(tǒng)的研究傳統(tǒng)回流法與現(xiàn)代微波法提取兩種工藝，發(fā)現(xiàn)單靠其中某一種方法都不能有效的提取多糖，而兩者按照一定的工藝條件有機(jī)結(jié)合則能使多糖提取率大幅度增加，實(shí)現(xiàn)高提取率，達(dá)到方法的優(yōu)化.

長時間和高功率的微波輻射都可能會使多糖糖鏈斷裂，但是這并沒有影響微波工藝的優(yōu)越性，微波的輔助萃取仍為一個好方法.微波與回流有機(jī)結(jié)合在一起，短時間內(nèi)微波使植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，在后續(xù)的水提過程中，加速了溶劑分子對基體的滲透和待提取成分的溶劑化，從而大大加快提取速度，提高了多糖的提取率.

微波輔助提取五味子多糖最佳工藝條件為料液比1 15、溫度100℃、萃取25 min、微波功率900 W、藥材粒徑為40目.在此條件下，提取率達(dá)到20.08%.表明微波微波輔助萃取五味子多糖耗費(fèi)時間少，溶劑用量小，且能顯著提高多糖的提取率，因此微波輔助法是提取北五味子多糖的一種優(yōu)先選擇方法.

［1］ Huang T H，Shen P N，Shen Y J.J.Chromatography A［J］.2005，1066:239-242.

［2］ 可成友，馬春雁，邊薔，等.五味子多糖研究概況分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1729-1731.

［3］ Amira M，Gamal-Eldeen，Eman F A h med，et al.In vitro canner chemo-preventive properties of polysaccharide extract from the brown alga，Sargassum latifolium［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(6):1378-1384.

［4］ 閆舒，仰榴青，趙婷等.五味子多糖最新研究進(jìn)展［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，19(4):366-368.

［5］ 孟憲軍，李冬男，汪艷群等.五味子多糖超聲波提取條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(4):313-319.

［6］ 高曉旭，孟憲軍，李繼海等.北五味子多糖超聲波提取條件的優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(9):27-30.

［7］ 高曉旭，李繼海，姜貴全等.北五味子多糖超聲波提取及對油脂的抗氧化性能［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，37(4):34-36.

［8］ 可成友，梁宏斌，吳曉芳等.北五味子多糖的酶法提取工藝研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24(2):47-50.

［9］ 趙晨晨，承 偉，王立冬.微波輔助提取絡(luò)石藤總黃酮的工藝研究［J］.中草藥，2012，43(3):718-720.

［10］皺建國，劉飛，劉燕燕等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取枳殼中總黃酮工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33(2):24-28

［11］ Dubois M，Gilles K A，Hamilton，J K，et al.colorimetric method for determination ofsugars and related substances［J］.Analytical Chemistry.1956，28:350-356.

［12］趙文竹，殷涌光，于志鵬等.玉米須多糖微波提取工藝及其紅外光譜結(jié)構(gòu)分析［J］.吉林大學(xué):工學(xué)版，2012，42(2):515-519.

［13］薛梅，周靜.五味子多糖的提取及含量測定［J］.陜西中醫(yī)，2003，24(3):267-268.

［14］譚曉虹，王治寶，李如章.北五味子多糖的提取和含量測 定［J］.時 珍 國 醫(yī) 國 藥，2007，18(6):1463-1464.

［15］孟憲軍，李冬男，汪艷群等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化五味子多糖的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31(4):11-115.

［16］李超，王磊，仁遙等.黑木耳多糖的微波提取及含量測定［J］.食品工業(yè)，2012，33(8):128-131.

［17］李巧云，居紅芳，翟春.五味子多糖提取工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(5):105-109.