他汀類藥物穩定載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用

周曉斌，楊麗霞，郭明，劉莉，郭瑞威，梁星

基礎與實驗研究

他汀類藥物穩定載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用

周曉斌，楊麗霞，郭明，劉莉，郭瑞威，梁星

目的：明確他汀類藥物在載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠中穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

方法：將24只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為對照組（n=12）和他汀組（n=12），高脂飼養建立動脈粥樣硬化模型。他汀組用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，8周后處死所有小鼠取主動脈弓制成石蠟切片，行蘇木素伊紅染色、免疫組化、天狼星紅染色，評估斑塊的相對面積、斑塊穩定性（用纖維帽厚度/內膜中層厚度表示）、斑塊易損指數[VI＝（脂質空泡+巨噬細胞）/（平滑肌細胞+膠原纖維）]。

結果：與對照組相比，他汀組小鼠的斑塊相對面積減小[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），P＜0.01]，纖維帽厚度/內膜中層厚度增加[（71.52±16.48）vs （51.93±21.94），P＜0.05]，易損指數降低[（2.73±2.02）vs （8.94±0.67），P＜0.05）。他汀組斑塊內含有較少的脂質空泡[（0.51±0.11）vs（0.62±0.10），P＜0.05]和巨噬細胞[（0.06±0.04）vs（0.09±0.04），P＜0.05]，較多的平滑肌纖維[（0.18±0.05） vs （0.10±0.06），P＜0.01]和膠原纖維[（0.08±0.06） vs（0.03±0.04），P＜0.05]。

結論：他汀類藥物增加ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。

他汀；冠狀動脈粥樣硬化；不穩定斑塊

Methods: A total of 24 ApoE-/-mice at 8 weeks of age were used, the atherosclerosis model was established by high fat diet for 8 weeks and the mice were randomized into 2 groups. Statin group, the mice were lavaged with atorvastatin 10 mg/(kg.d) and Control group, the mice received normal saline. n=12 in each group. The HE staining, Sirius red staining and immuneohistochemistry staining were respectively conducted to evaluate the relative plaque area, the fi brous cap thickness/tunica intima media thickness (FCT/IMT) and the plaque vulnerability index (VI), VI = lipoid vesicles+ macrophages/smooth muscle cells + collagen.

Results: Compared with Control group, Statin group showed smaller plague area (0.46±0.09) vs (0.36±0.09), P<0.01, higher ratio of FCT/IMT (51.93±21.94) vs (71.52±16.48), P<0.05, and decreased VI (8.94±0.67) vs (2.73±2.02), P<0.05. Compared with Control group, the plaque in Statin group had less lipoid vesicles (0.62±0.10) vs (0.51±0.11), less macrophages (0.09±0.04) vs (0.06±0.04), all P<0.05 and more smooth muscle cells (0.10±0.06) vs (0.18±0.05), P<0.01, more collagen (0.03±0.04) vs (0.08±0.06), P<0.05.

Conclusion: Statin increased the stability of the atherosclerosis plaque in ApoE-/-mice.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:296.)

急性冠狀動脈（冠脈）綜合征主要歸咎于易損斑塊的破裂，對易損斑塊研究是目前心血管領域的熱點和難點。病理學研究證明，易損斑塊的特點是斑塊中膠原和平滑肌細胞減少，纖維帽變薄，脂質池周圍有大量的活化巨噬細胞浸潤。循證醫學證據提示，目前唯一公認的穩定斑塊的藥物為他汀類藥物，但對其穩定斑塊的機制尚無統一定論，本研究評估了阿托伐他汀干預載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的動脈粥樣硬化斑塊的作用，試圖探討他汀類藥物穩定斑塊的機制。

1 材料與方法

實驗材料：2011-01至2012-05，實驗動物為8周齡ApoE-/-雄性小鼠24只，平均體重（23.39±1.12）g，購于北京大學醫學部動物實驗中心，動物質量合格證號：SCXK（京）2009-007。

主要試劑：阿托伐他汀原藥（美國輝瑞公司贊助），蘇木素伊紅（成都科龍化工公司），SV-0002免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），DAB 顯色液（ZLI-9032，北京中杉金橋），巨噬細胞抗體 MAC387（Abcom公司，美國），平滑肌細胞抗體 α-actin（Santa Cruz公司，美國），天狼星紅-飽和苦味酸液（成都科龍化工公司），天青石藍液（成都科龍化工公司）。主要儀器設備：石蠟切片機（A130328，中國），熒光倒置顯微鏡（Leica DMIRB，德國），Leica DFC圖像采集軟件（Leica microsystems，德國），圖像分析軟件IPP 6.0（Media Cybernetics，美國）。

動物飼養：用普通飼料適應性喂養8周齡的ApoE-/-小鼠，1周后開始高脂飼養，高脂飼料配方為普通飼料+1.25%膽固醇+15%豬油。小鼠飼養條件：清潔（SPF級）動物房，溫度18～22℃，濕度50%～60%，12 h/12 h光照/黑暗交替實驗環境飼養。保持室內空氣新鮮，氨濃度不超過20 ppm，換氣次數應10～20次/h。墊料選用闊葉林木的鋸末，經消毒滅菌處理后使用，每日更換墊料。飲水標準不低于城市生活飲水的衛生標準，用飲水瓶給水，每日換水。

試驗分組與干預：用隨機數字法將24只ApoE-/-小鼠分為對照組和他汀組，每組各12只。從第9周齡開始干預，他汀組用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，對照組用等量生理鹽水灌胃，每日灌胃量定為3 ml，每晚1次。每周稱體重以調整小鼠的給藥濃度。第17周齡末處死所有小鼠。

制作標本：取小鼠主動脈弓，用新鮮配制好的4%多聚甲酫固定。制成石蠟切片，每張切片厚度為10 μm。每隔相鄰的10張切片取1張做蘇木素伊紅染色。主要步驟為：脫蠟至水，蘇木素染色 5 min，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，0.5%伊紅液染色 1～3 min，脫水透明，中性樹膠封片。根據蘇木素伊紅染色結果，每只小鼠選取斑塊面積最大的1張切片測量斑塊相對面積，纖維帽厚度/內膜中層厚度和脂質空泡相對面積，其后連續的3張切片分別做巨噬細胞免疫組化，平滑肌細胞免疫組化，膠原纖維天狼星紅染色。

免疫組化主要步驟：脫蠟至水后，3%H2O2覆蓋組織5 min去除過氧化物酶。微波抗原修復，溫度嚴格控制在92～96℃。室溫下封閉20 min。每個組織區域加入1:200稀釋的抗體30 μl，陰性對照加入等量的蒸餾水，4℃過夜。加入聚合HRP標記抗兔IgG（SV-0002），37℃孵育30 min。二氨基聯苯胺（DAB）顯色后蘇木素復染10 min。脫水透明，中性樹膠封片。

天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，加入天青石藍液10 min，蒸餾水沖洗3次，天狼星紅飽和苦味酸液1 h，蘇木素液淡染細胞核，無水乙醇分化與脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

IPP圖像分析：斑塊相對面積＝斑塊面積/血管腔面積，斑塊穩定性＝纖維帽厚度/內膜中層厚度，纖維帽厚度＜65 μm定義為不穩定斑塊，脂質空泡相對含量＝脂質空泡面積/斑塊面積，組織相對表達＝斑塊內目標細胞累積光密度值/斑塊面積，易損指數（VI）＝（巨噬細胞+脂質空泡）/（平滑肌細胞+膠原纖維）。

統計學方法：應用SPSS 17.0統計軟件分析數據。數據用均數±標準差表示。兩組間均值比較采用成組t檢驗，方差不齊選擇t′檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積比較

顯微鏡下觀察，他汀組與對照組皆有斑塊生長。對照組的動脈內膜明顯增厚，斑塊面積較大，斑塊周圍可見明顯的上皮細胞增生；他汀組的動脈內膜稍增厚，斑塊面積較小（圖1）。統計結果顯示他汀組斑塊面積小于對照組[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），t=2.850，P＜0.01）]，差異有統計學意義。表1

表1 兩組小鼠主動脈斑塊數據匯總

2.2兩組小鼠主動脈斑塊的穩定性比較

用纖維帽厚度/內膜中層厚度代表斑塊的穩定性，他汀組小鼠的斑塊穩定性大于對照組 [（0.56±0.09）vs（0.26±0.13），t=-6.913，P＜0.01]，差異有統計學意義（表1）。根據纖維帽厚度＜65 μm定義為不穩定斑塊[1]，他汀組主要為穩定斑塊（51.93±21.94） μm，對照組主要為不穩定斑塊（71.52±16.48） μm，t=-2.318，P＜0.05，兩組差異有統計學意義。表1

2.3兩組小鼠主動脈斑塊內脂質空泡含量的比較

分析蘇木素伊紅染色結果（圖2），脂質空泡的含量間接代表脂質的相對含量，他汀組小鼠主動脈斑塊內脂質空泡明顯少于對照組[（0.51±0.11） vs（0.62±0.09），t=2.597，P＜0.05]，差異有統計學意義。表1

2.4兩組小鼠主動脈斑塊內巨噬細胞數量的比較

免疫組化結果顯示：斑塊內巨噬細胞被染色黃褐色（圖3箭頭所指）。對照組小鼠主動脈斑塊斑塊內大量巨噬細胞浸潤，多分布于斑塊的肩部，而他汀組小鼠主動脈斑塊斑塊內巨噬細胞較少。統計結果顯示：他汀組巨噬細胞的含量少于對照組[（0.06±0.04）vs （0.09±0.04），t=2.083，P＜0.05]，差異有統計學意義。表1

2.5兩組小鼠主動脈斑塊內平滑肌細胞數量的比較

斑塊內平滑肌細胞后被染成褐色（圖4箭頭所指），顯微鏡下觀察，對照組小鼠主動脈斑塊纖維帽內平滑肌層菲薄，而他汀組纖維帽內含有較厚的平滑肌層。統計結果顯示，他汀組斑塊內平滑肌細胞含量明顯多于對照組[（0.18±0.05）vs （0.10±0.06）]，差異有統計學意義（t=-3.445，P＜0.01）。表1

2.6兩組小鼠主動脈斑塊內膠原纖維含量的比較

用天狼星紅染色顯示膠原成份，斑塊內Ⅰ型膠原纖維被染成紅色和黃色，Ⅲ型膠原纖維被染成綠色（圖5箭頭所示），他汀組含有豐富的膠原成分。統計結果顯示：他汀組的膠原含量明顯多于對照組[（0.08±0.06）vs（0.03±0.04）]，差異有統計學意義（t'=-2.388，P＜0.05）。表1

圖1 兩組ApoE-/-小鼠主動脈內斑塊相對面積比較（×100）

圖2 兩組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內脂質空泡含量比較（×100）

圖3 兩組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內巨噬細胞含量比較（×100）

圖4 兩組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內平滑肌細胞含量比較（×100）

圖5 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內膠原含量比較（×100）

2.7兩組小鼠的易損指數比較

與對照組相比，他汀組小鼠主動脈粥樣硬化斑塊內促進斑塊不穩定的成份（如脂質和巨噬細胞）含量減少，增加斑塊穩定性的成份（如平滑肌細胞和膠原纖維）增多。統計結果顯示，他汀組斑塊易損指數明顯低于對照組[（2.73±2.02）vs（8.94±0.67），t'=2.417，P＜0.05]，差異有統計學意義。表1

3 討論

本研究采用斑塊相對面積，纖維帽厚度/內膜中層厚度，易損指數等指標來評估易損斑塊，從脂質、巨噬細胞、平滑肌細胞和膠原纖維等角度探討他汀穩定斑塊的作用機制。

他汀可減少動脈粥樣硬化斑塊大小及增加斑塊的穩定性。Insull等[2]證明他汀可減少冠心病患者動脈粥樣硬化斑塊的大小；臨床研究證明他汀可明顯減少斑塊的黃色病變期（不穩定斑塊），從而發揮穩定冠狀動脈粥樣硬化斑塊的作用[3]，Takarada等[4]證實他汀可增加心肌梗塞患者斑塊纖維帽厚度。以上試驗證明了他汀對人動脈粥樣硬化的治療作用，但無法對斑塊大小及穩定性做精確直接的測量。我們對斑塊穩定性的評估不僅從斑塊大小的水平上采用了纖維帽厚度和纖維帽厚度/內膜中層厚度的指標，而且從斑塊組成成分的角度上引入了易損指數的指標[5]，從兩個層面證實了他汀對斑塊易損性的影響。通過8周的干預，他汀使ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的相對面積減少了21.7%，同時使斑塊的穩定性增加了37.7%。

動脈粥樣硬化斑塊影響穩定性的重要成分為脂質，主要包括兩部分：脂質池和攝取了脂質的巨噬細胞（即泡沫細胞）。Tsuchiya等[6]研究證明了動脈粥樣硬化斑塊內脂質沉積和巨噬細胞浸潤與他汀的干預有直接關系。本研究證明他汀明顯減少ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊內脂質和巨噬細胞的含量，從而增加了斑塊的穩定性。此作用可能得益于他汀的調脂機制，即降低血清低密度脂蛋白膽固醇的濃度，減少脂質在斑塊內的沉積；也可能通過抑制巨噬細胞的促炎癥、斑塊破裂以及血栓的作用，達到抗動脈粥樣硬化的作用。

平滑肌細胞和膠原纖維共同構成了斑塊內的“鋼性骨架”，維持斑塊的穩定性。我們的實驗結果顯示：他汀增加了動脈粥樣硬化斑塊內平滑肌細胞和膠原纖維的含量。其抗動脈粥樣硬化的相關機制可能與下列因素有關：疾病初期，他汀抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移，促進血管平滑肌細胞凋亡，抑制斑塊的形成；疾病發展期，他汀抑制巨噬細胞及平滑肌細胞分泌基質金屬蛋白酶，同時誘導巨噬細胞及血管平滑肌細胞表達和分泌組織型金屬蛋白酶抑制物因子-1，以抑制膠原降解，從而使斑塊趨于穩定。

綜上所述，大劑量他汀可減少動脈粥樣硬化斑塊的正性重構，穩定動脈粥樣硬化斑塊；他汀可能通過多種機制減少斑塊內脂質和沉積和巨噬細胞的浸潤，增加了平滑肌細胞和膠原的含量，從而降低了斑塊的易損性。本研究進一步為他汀穩定動脈粥樣硬化斑塊的機制提供了多角度的思考，但對這一機理的全面而深入的闡釋尚需要更多證據的支持。

[1] Burke AP, Farb A, Malcom GT, et al. Coronary risk factors and plaque morphology in men with coronary disease who died suddenly. N Engl J Med, 1997, 336: 1276-1282.

[2] Insull W Jr. The pathology of atherosclerosis: plaque development and plaque responses to medical treatment. Am J Med, 2009, 122(1 Suppl): S3-S14.

[3] Hirayama A, Saito S, Ueda Y, et al. Plaque-stabilizing effect of atorvastatin is stronger for plaques evaluated as more unstable by angioscopy and intravenous ultrasound. Circ J, 2011, 75: 1448-1454.

[4] Takarada S, Imanishi T, Kubo T, et al. Effect of statin therapy on coronary fibrous-cap thickness in patients with acute coronary syndrome: assessment by optical coherence tomography study. Atherosclerosis, 2009, 202: 491-497.

[5] Meng X, Li W, Yang J, et al. Regulatory T cells prevent plaque disruption in apolipoprotein E-knockout mice. Int J Cardiol, 2013, 168: 2684-2692.

[6] Tsuchiya A, Nagotani S, Hayashi T, et al. Macrophage infiltration, lectin-like oxidized-LDL receptor-1, and monocyte chemoattractant protein-1 are reduced by chronic HMG-CoA reductase inhibition. Curr Neurovasc Res, 2007, 4: 268-273.

Statin Stabilized the Atherosclerosis Plaque in Apo-lipoprotein E Gene Knockout Mice

ZHOU Xiao-bin, YANG Li-xia, GUO Ming, LIU Li, GUO Rui-wei, LIANG Xing.
Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming (650032), Yunnan, China Corresponding Author: YANG Li-xia, E-mail:doctorylixia@aliyun.com

Objective: To clarify the plaque stabilization effect of statin in the apo-lipoprotein E gene knockout (ApoE-/-) mice.

Statin; Atherosclerosis; Vulnerable plague

2013-09-26）

（助理編輯：許菁）

650032 云南省昆明市，成都軍區昆明總醫院 心血管內科（周曉斌、楊麗霞、郭瑞威、梁星）；武警云南省總隊醫院（郭明、劉莉）

周曉斌 碩士研究生 主要從事心血管病基礎研究 Email: doctorzhouxiaobin@163.com. 通訊作者：楊麗霞 Email: doctorylixia@aliyun.com

R54

A

1000-3614（2014）04-0296-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.015