趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

張小娟，任滿意，曹曉青，張春盛，劉同寶

基礎與實驗研究

趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

張小娟，任滿意，曹曉青，張春盛，劉同寶

目的：探討趨化因子受體6（CCR6）基因敲除對ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其作用機制。

方法：雜交培育CCR6基因敲除（CCR6-/-）ApoE-/-小鼠20只作為實驗組，普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠20只作為對照組，給予高脂飲食。12周后將小鼠處死進行取材固定，主動脈根部冰凍切片進行蘇木素伊紅（HE）染色、油紅O染色及巨噬細胞和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的免疫組化染色，對斑塊的形態、面積及組成進行觀測。并培育巨噬細胞，進行了噻唑藍比色實驗及細胞遷移實驗，對機制進一步分析。

結果：實驗組與對照組相比斑塊面積顯著減小[（8.3±1.9）% vs （16.1±2.0）%， P＜0.05]；實驗組與對照組相比主動脈根部脂質沉積 [（14.4±2.1）% vs （28.5±3.4）%] 及主動脈大體脂質沉積[（4.9±2.8）% vs （13.6±3.2）%] 均提示實驗組脂質沉積顯著減?。≒＜0.05）；實驗組與對照組相比斑塊內巨噬細胞[（18.9±2.8）% vs （35.7±4.5）%] 及MCP-1表達減少[(16.3±2.2) % vs （23.1±5.6）%]。差異均有統計學意義（P＜0.05）。

結論：CCR6通過影響脂質沉積、巨噬細胞增殖遷移促進動脈粥樣硬化的形成。

動脈粥樣硬化；趨化因子受體6；巨噬細胞；單核細胞趨化蛋白1

Methods: Our research included 2 groups, Experimental group, n=20 CCR6-/-ApoE-/-mice and Control group, n=20 CCR6+/+ApoE-/-mice. Both groups received high-fat diet for 12 weeks, and then, the aortic roots were collected for HE staining, the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in macrophages for immune-histochemisty staining, the macrophages were cultured for migration study, and the results were compared between 2 groups.

Results: The plaque areas in Experimental group was signif i cantly smaller than those in Control group, (8.3±1.9) % vs (16.1±2.0) %, P<0.05. The Experimental group had less lipid deposition in aortic root, (14.4±2.1) % vs (28.5±3.4) %, and less lipid deposition in aorta (4.9±2.8) % vs (13.6±3.2) %, all P<0.05. The Experimental group showed less macrophages and lower MCP-1 expression in plaques, (18.9±2.8) % vs (35.7±4.5) % and (16.3±2.2) % vs (23.1±5.6) %, all P<0.05.

Conclusion: CCR6 promotes atherogenesis plaque formation by lipid deposition and macrophage migration in ApoE-/-mice.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:300.)

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以脂質斑塊在動脈壁聚積為特征的疾病，伴有動脈管壁增厚變硬、血管彈性減退及管腔縮窄。隨著研究的深入，人們發現動脈粥樣硬化是一種巨噬細胞介導

的，多種炎癥因子參與的炎癥性疾病[1]。血液中脂質在管壁的過度沉積造成內皮細胞損傷，單核細胞浸潤，當單核細胞從損傷的內皮細胞之間移行至內膜下后，在各種炎癥介質的刺激下活化為巨噬細胞，又是動脈粥樣硬化發生發展的關鍵步驟[2]。

巨噬細胞遷移的過程以及導致其遷移的趨化因子及其受體已經成為關注的焦點。趨化因子通過特異性地偶聯其在靶細胞表面的G蛋白偶聯受體而調節白細胞的遷移。在眾多的趨化因子和受體中，趨化因子受體6 （chemokine receptor 6, CCR6）及其配體CC趨化因子配體20（C-C chemokine ligand 20，CCL20）被認為具備穩定內環境的功能，新近發現它們同樣能在炎癥中發揮作用[3]。本研究利用CCR6基因敲除（CCR6-/-）及載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠分析CCR6在動脈粥樣硬化發生過程中發揮的作用。

1 材料和方法

1.1動物來源、飼養及分組

動物模型的建立：于2012-03至2013-06，將清潔級6周齡雌性ApoE-/-小鼠（維通利華，北京，中國）和CCR6-/-小鼠（Jackson Labs，Bar Harbor, Maine 04609 USA）進行雜交培養，飼養于山東大學實驗動物中心。

分 組：20只 8周 齡 的 雜 交 培 育 CCR6-/-ApoE-/-小鼠納入實驗為實驗組，對照組為20只普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠。兩組小鼠均給予高脂飼料（含膽固醇0.15%，脂肪21%）喂養12周后，將小鼠處死并行血清血脂及主動脈病理學檢查。

1.2檢測指標

蘇木素伊紅（HE）染色：取冰凍切片常規做HE染色，從每只小鼠主動脈根部連續切片，每間隔5張取l張，共取3張切片。在光學顯微鏡下觀察斑塊大小，用多功能彩色病理圖像分析系統軟件（ImagePro-Plus soft-ware）分別測出斑塊面積及血管內、外膜長度，回歸標準圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積之比。

油紅O染色：制備冰凍切片，常規行油紅O染色，在光學顯微鏡下觀察斑塊內脂質含量的多少。完整取下小鼠主動脈，剝離主動脈外膜，拋開主動脈行油紅O染色，ImagePro-Plus soft-ware計算脂質與血管面積之比。

免疫組化染色：冰凍切片晾干30 min，入蒸餾水中水化30 min，再入0.3%過氧化氫（H2O2）溶液內室溫100 min。然后血清封閉1 h，以減少非特異性反應。抗單核—巨噬細胞標志物抗體（Monocyte/ Macrophage Marker，MOMA-2，1：200）檢測組織切片中巨噬細胞表達[4]，抗單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）抗體（1：100）檢測組織切片中MCP-1表達。在光學顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達，采用ImagePro-Plus soft-ware做圖像數字采集及半定量分析。

1.3細胞實驗

細胞培養：小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞購自American Type Culture Collection （ATCC,美國標準生物品收藏中心）,用含有10%胎牛血清（杭州四季青公司）的RPMI1640（GIBCO，Life Technologies，上海，中國）培養基在37℃、5%的二氧化碳（CO2）培養箱中培養，2～3 d細胞長滿，即可傳代培養。

蛋白質印跡法（Western blot）：細胞經過裂解后，4℃，12 000 g離心10 min，二辛可寧酸法蛋白檢測（bicinchoninic acid protein assay, BCA）法定量檢測蛋白質濃度[5]。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸使蛋白質變性。相同蛋白含量的提取液加入積層膠90 V，分離膠120 V，電泳分離細胞蛋白，200 mA將膠上的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗（兔抗小鼠MCP-1濃度1：1000），4℃孵育6～12 h。TBST（Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.5%, pH=7.6）洗膜3次，每次5～10 min。加入二抗（山羊抗兔二抗1：20 000），室溫孵育2 h，Tris鹽水吐溫緩沖液（TBST）洗膜3次。最后加入顯影液，印記曝光于X光片上后，進行圖像分析。

噻唑藍比色（MTT）實驗：將RAW264.7細胞消化成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞的濃度將經小分子干涉RNA（siRNA）干擾的細胞和對照組細胞分別加入96孔板，每孔200 μl。12 h后每孔均加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續孵育4 h后，棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min使結晶物充分溶解，選擇490 nm波長檢測每孔吸光度，并繪制生長曲線。

細胞遷移（Transwell）實驗：24孔板內每孔加有600 μl的培養基（含10%血清），后在細胞遷移的內室分別加入經或未經siRNA處理的RAW264.7細胞（100 μl，含0.1%血清），放入培養箱，12 h后，取出細胞遷移，用棉簽擦去聚碳酸膜（PVPF膜）靠近內室那一面的細胞，另一面的細胞用甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色20 min，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細胞，記數。

CCR6 siRNA干擾實驗：CCR6 siRNA試劑盒購

自 Selleck （Houston, TX 77054 USA），500 μl Opti-MEM（GIBCO）稀釋siRNA （轉染細胞的終濃度為33 nM），500 μl Opti-MEM稀釋1.0 μl LipofectamineTM2000 （Invitrogen, Life Technologies，上海），輕輕吹吸3 次混勻，室溫下靜置5 min?；旌限D染試劑和siRNA 稀釋液，室溫下靜置20 min。轉染復合物加入到6孔細胞板中，1 ml/孔轉染6 h后換新鮮培養基。

1.4統計學分析

應用SPSS 13.0統計軟件進行分析。測量數據以均值±標準差表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊形成

HE染色結果表明，對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊，占管腔面積為[(16.1±2.0)%]，實驗組亦可見斑塊形成，但斑塊面積[(8.3±1.9)%]顯著少于對照組（圖1），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內脂質沉積

油紅O染色發現：對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊，內含大量紅染脂質，占斑塊面積的（28.5±3.4）%；實驗組亦可見斑塊形成，但斑塊內紅染脂質（14.4±2.1）%顯著少于對照組（圖2A），差異有統計學意義（P＜0.05）。主動脈大體仍然可以發現：對照組斑塊中的紅染面積[（13.6±3.2）%]顯著大于實驗組[（4.9±2.8）%]（圖2B），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內巨噬細胞聚集

單核—巨噬細胞表面特異性標志抗原抗體染色結果：對照組可見小鼠主動脈根部單核—巨噬細胞[（35.7±4.5）%]表達強陽性，實驗組主動脈根部單核—巨噬細胞[（18.9±2.8）%]顯著減少（圖3）,差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4趨化因子受體6 siRNA 抑制巨噬細胞增殖遷移

噻唑藍比色實驗結果顯示，CCR6 siRNA干預6 h后，實驗組與對照組相比[（129.4±12.2）vs （113.8±9.4）] 和 CCR6 siRNA干 預 12 h [（147.2±13.5） vs（126.7±15.3）] ，差異均有統計學意義（P＜0.05）。細胞遷移實驗結果顯示，CCR6 siRNA干預24 h后，實驗組與對照組相比能夠顯著抑制巨噬細胞的遷移（183.4±19.3 vs 122.8±8.7），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠（n=20）主動脈根部蘇木素伊紅染色結果

圖2 兩組小鼠（n=20）油紅O染色結果

圖3 兩組小鼠（n=20）主動脈根部單核—巨噬細胞免疫組化染色結果

2.5趨化因子受體6基因敲除抑制單核細胞趨化蛋白1表達

MCP-1免疫組化研究結果表明，實驗組小鼠主動脈根部MCP-1[（16.3±2.2）%]表達顯著低于對照組[（23.1±5.6）%]（圖4），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 趨化因子受體6促進單核細胞趨化蛋白1表達

3 討論

趨化因子(chemokines)是由小分子分泌蛋白組成的一個大的細胞因子超家族, 能趨化細胞作定向移動，在各種生物學反應中發揮著重要作用。趨化因子受體是異三聚體G蛋白耦聯受體,有7個跨膜區。根據受體結合的趨化因子種類的不同將受體分為4類:CR、CCR(CCR12CCR9) 、CXCR(CXCR12CXCR5)及CX3CR。

CCR6是巨噬細胞炎癥蛋白3α（MIP-3α/ CCL20）的受體,CCR6表達于多種白細胞亞型，包括樹突狀細胞、B細胞、TH17細胞、NK細胞、中性粒細胞等[4,5]。Ruth等[6]的研究表明，CCL20-CCR6在體外實驗中能導致單核細胞的趨化；而Le Borgne等[7]的研究進一步表明，CCL20-CCR6能夠在體內導致皮炎小鼠單核細胞的聚集。經靜脈注射CCL20同樣引起單核巨噬細胞的聚集。對于靜止的單核巨噬細胞和中性粒細胞來說，CCR6的表達是低水平的，但是在動脈粥樣硬化相關細胞因子的刺激下CCR6的表達水平會迅速升高。最近研究甚至表明，CCR6在具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型兩種巨噬細胞上表達水平相當。與健康動脈相比，無論是人的還是小鼠的動脈粥樣硬化的冠狀動脈和頸動脈中，CCR6和CCL20的表達均明顯升高[8,9]。

本研究中，我們利用CCR6-/-敲基因小鼠第一次證明CCR6直接參與了動脈粥樣硬化的發生發展。本研究完成CCR6-/-ApoE-/-雙敲小鼠模型的構建，利用HE染色證明，與對照組相比，實驗組小鼠斑塊面積明顯減少，這說明CCR6的存在能夠促進斑塊的增長。對主動脈根部及主動脈大體進行油紅O染色，與對照組相比，實驗組小鼠斑塊內脂質沉積明顯減少，表明CCR6的存在直接或間接參與了脂質的轉運。

為了進一步研究CCR6影響斑塊形成及發展的機制，我們對斑塊內的巨噬細胞進行了免疫組化染色，發現與對照組相比，實驗組小鼠斑塊內巨噬細胞含量明顯減少，這證明了CCR6在斑塊內能夠促進巨噬細胞的遷移。為了進一步明確CCR6對巨噬細胞增殖遷移的促進作用，我們在體外應用CCR6的siRNA阻斷CCR6的表達，結果表明阻斷CCR6后巨噬細胞增殖遷移活性均受到顯著影響。最后我們在體內和體外檢測了MCP-1的表達，結果顯示阻斷CCR6后MCP-1表達顯著減少，在體內體外均證明了這一結論。有研究表明，CCR6與其配體CCL20的結合能夠干擾血糖代謝并促進糖尿病的發病，而CCR6阻斷后能夠明顯抑制糖尿病的進展。此外作為趨化因子，CCR6參與多種細胞因子的代謝，所以其與內分泌存在關系，在以后的實驗中我們將進一步在這一領域做出研究。

動脈粥樣硬化已經成為嚴重威脅人類健康的疾病[10,11]，上述所有結果共同表明，CCR6在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中發揮了舉足輕重的作用。這一發現將為動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的依據。

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Effect of Chemokine Receptor 6 Knock-out on Atherosclerosis Plaque Formation in ApoE-/-Mice

ZHANG Xiao-juan, REN Man-yi, CAO Xiao-qing, ZHANG Chu-sheng, LIU Tong-bao.
Department of Cardiology, Shandong Provincial Chest Hospital, Jinan (250014), Shandong, China

Objective: To explore the effect of chemokine receptor 6 (CCR6) on atherosclerosis plaque formation in ApoE-/-mice.

Atherosclerosis; Chemokine receptor 6; Macrophage; Monocyte chemoattractant protein-1

2013-11-20)

（編輯：漆利萍）

250014 山東省濟南市，山東大學醫學院 山東省胸科醫院 心內科

張小娟 副主任醫師 碩士 主要從事冠心病臨床研究 Email: zxj13791050365@163.com 通訊作者：劉同寶 Email: liutongbao@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）04-0300-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.016