HPLC法測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量

勾曉丹

[摘要] 目的 測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，為止咳定喘丸的質(zhì)量研究提供依據(jù)。 方法 采用高相液相色譜（HPLC）法測(cè)定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）為流動(dòng)相，流量1.0 ml/min。 結(jié)果 建立了HPLC法測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9995），平均回收率為99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于止咳平喘丸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黃、石膏、紫蘇子（炒）、厚樸（姜制）、陳皮、罌粟殼（蜜炙）、甘草、茶葉等中藥材加工制成的復(fù)方純中藥制劑[1]，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第三冊(cè)》[2]。功能主治：清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。該藥原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，對(duì)其產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量無(wú)法控制。為控制止咳平喘丸的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法擬建立止咳平喘丸的質(zhì)量控制方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供方法，為定量指標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀（包括LC-2010型紫外檢測(cè)器）；LC Solution色譜工作站。

1.2 試劑與試藥

乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110820-200403）；止咳定喘丸（東芝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130203、130303、130403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱溫：30℃；體積流量：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)：按苦杏仁苷計(jì)算應(yīng)不低于7000，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取苦杏仁苷對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末3.5 g，精密稱(chēng)定，置塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液 按處方及工藝制備不含苦杏仁的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法學(xué)考察陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果色譜圖中在苦杏仁苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近未檢出干擾峰（圖1）。

圖1 止咳定喘丸HPLC色譜圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y=117 632X-347 713，r=0.9995。結(jié)果表明，苦杏仁苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD=0.18%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，分別依法處理后測(cè)定。結(jié)果RSD=0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品溶液，在室溫條件下放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值RSD=0.78%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的供試品（批號(hào)：130203，苦杏仁苷含量為3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供試品溶液方法制備，依法測(cè)定含量并計(jì)算回收率（表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量的測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液方法制備，分別進(jìn)樣10 μl，依法測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 樣品中苦杏仁苷的測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，苦杏仁苷在207 nm處有最大吸收，選用207 nm作檢測(cè)波長(zhǎng)，苦杏仁苷峰有最大峰面積，其他組分在此無(wú)干擾吸收。

苦杏仁苷的含量測(cè)定方法現(xiàn)多用HPLC法[3]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾按照參考文獻(xiàn)，用各種比例的甲醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性太差[4-5]，無(wú)法檢測(cè)，且出現(xiàn)雙齒峰，改用乙腈-水后，得到單峰，穩(wěn)定性明顯改善，且靈敏度也有所提高，苦杏仁苷色譜峰基本上達(dá)到了基線(xiàn)分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終建立了適合本品的含量測(cè)定方法，流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

綜合考慮提取分離中藥有效成分常用的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以甲醇為溶劑，由于溶劑浸提法、回流提取法和索式提取法提取時(shí)間較長(zhǎng)，超聲提取法提取時(shí)間短，且無(wú)其他組分峰干擾，因此選擇超聲提取法作為止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

經(jīng)筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在氣候變化明顯的季節(jié)，尤其是秋冬季節(jié)，咳嗽氣喘的患者很多。此藥功能主治為清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。用途廣泛且有一定的市場(chǎng)占有率，但原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，筆者認(rèn)為本研究闡述的檢驗(yàn)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、陰性對(duì)照無(wú)干擾、方法可靠，使止咳定喘丸原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到充實(shí)和完善[8-9]，更能準(zhǔn)確、有效地控制止咳定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：187-188.

[2] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第三冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：41.

[3] 袁丹，胡爽，畢開(kāi)順，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方制劑中苦杏仁苷含量的研究[J].藥物分析雜志，2002，22（5）：361.

[4] 劉小平，李湘南，徐海星.中藥分離工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：60-74.

[5] 井山林，袁鑄人，彭國(guó)平.杏貝止咳顆粒中苦杏仁苷的HPLC測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35（2）：104-105.

[6] 王力生，鄒節(jié)明，袁偉恩，等.苦杏仁的炮制及有效成分提取和分析進(jìn)展[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2005，11（1）：34-38.

[7] 鐘文，唐新，謝培德，等.HPLC測(cè)定止帶消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成藥，2006，28（5）：766-767.

[8] 何世新，解丹平，封海霞.HPLC測(cè)定益肺膠囊中苦杏仁苷的含量[J].中國(guó)藥事，2007，21（11）：910-913.

[9] 甄攀.麻杏止咳片中杏仁苷的HPLC測(cè)定[J].中成藥，2003， 25（2）：115-116.

（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：林利利）

[摘要] 目的 測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，為止咳定喘丸的質(zhì)量研究提供依據(jù)。 方法 采用高相液相色譜（HPLC）法測(cè)定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）為流動(dòng)相，流量1.0 ml/min。 結(jié)果 建立了HPLC法測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9995），平均回收率為99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于止咳平喘丸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黃、石膏、紫蘇子（炒）、厚樸（姜制）、陳皮、罌粟殼（蜜炙）、甘草、茶葉等中藥材加工制成的復(fù)方純中藥制劑[1]，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第三冊(cè)》[2]。功能主治：清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。該藥原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，對(duì)其產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量無(wú)法控制。為控制止咳平喘丸的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法擬建立止咳平喘丸的質(zhì)量控制方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供方法，為定量指標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀（包括LC-2010型紫外檢測(cè)器）；LC Solution色譜工作站。

1.2 試劑與試藥

乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110820-200403）；止咳定喘丸（東芝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130203、130303、130403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱溫：30℃；體積流量：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)：按苦杏仁苷計(jì)算應(yīng)不低于7000，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取苦杏仁苷對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末3.5 g，精密稱(chēng)定，置塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液 按處方及工藝制備不含苦杏仁的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法學(xué)考察陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果色譜圖中在苦杏仁苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近未檢出干擾峰（圖1）。

圖1 止咳定喘丸HPLC色譜圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y=117 632X-347 713，r=0.9995。結(jié)果表明，苦杏仁苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD=0.18%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，分別依法處理后測(cè)定。結(jié)果RSD=0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品溶液，在室溫條件下放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值RSD=0.78%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的供試品（批號(hào)：130203，苦杏仁苷含量為3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供試品溶液方法制備，依法測(cè)定含量并計(jì)算回收率（表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量的測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液方法制備，分別進(jìn)樣10 μl，依法測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 樣品中苦杏仁苷的測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，苦杏仁苷在207 nm處有最大吸收，選用207 nm作檢測(cè)波長(zhǎng)，苦杏仁苷峰有最大峰面積，其他組分在此無(wú)干擾吸收。

苦杏仁苷的含量測(cè)定方法現(xiàn)多用HPLC法[3]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾按照參考文獻(xiàn)，用各種比例的甲醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性太差[4-5]，無(wú)法檢測(cè)，且出現(xiàn)雙齒峰，改用乙腈-水后，得到單峰，穩(wěn)定性明顯改善，且靈敏度也有所提高，苦杏仁苷色譜峰基本上達(dá)到了基線(xiàn)分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終建立了適合本品的含量測(cè)定方法，流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

綜合考慮提取分離中藥有效成分常用的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以甲醇為溶劑，由于溶劑浸提法、回流提取法和索式提取法提取時(shí)間較長(zhǎng)，超聲提取法提取時(shí)間短，且無(wú)其他組分峰干擾，因此選擇超聲提取法作為止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

經(jīng)筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在氣候變化明顯的季節(jié)，尤其是秋冬季節(jié)，咳嗽氣喘的患者很多。此藥功能主治為清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。用途廣泛且有一定的市場(chǎng)占有率，但原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，筆者認(rèn)為本研究闡述的檢驗(yàn)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、陰性對(duì)照無(wú)干擾、方法可靠，使止咳定喘丸原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到充實(shí)和完善[8-9]，更能準(zhǔn)確、有效地控制止咳定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：187-188.

[2] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第三冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：41.

[3] 袁丹，胡爽，畢開(kāi)順，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方制劑中苦杏仁苷含量的研究[J].藥物分析雜志，2002，22（5）：361.

[4] 劉小平，李湘南，徐海星.中藥分離工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：60-74.

[5] 井山林，袁鑄人，彭國(guó)平.杏貝止咳顆粒中苦杏仁苷的HPLC測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35（2）：104-105.

[6] 王力生，鄒節(jié)明，袁偉恩，等.苦杏仁的炮制及有效成分提取和分析進(jìn)展[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2005，11（1）：34-38.

[7] 鐘文，唐新，謝培德，等.HPLC測(cè)定止帶消糜栓中苦杏仁苷的含量[J].中成藥，2006，28（5）：766-767.

[8] 何世新，解丹平，封海霞.HPLC測(cè)定益肺膠囊中苦杏仁苷的含量[J].中國(guó)藥事，2007，21（11）：910-913.

[9] 甄攀.麻杏止咳片中杏仁苷的HPLC測(cè)定[J].中成藥，2003， 25（2）：115-116.

（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：林利利）

[摘要] 目的 測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，為止咳定喘丸的質(zhì)量研究提供依據(jù)。 方法 采用高相液相色譜（HPLC）法測(cè)定止咳平喘丸中苦杏仁的活性成分苦杏仁苷的含量；使用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸（8∶92）為流動(dòng)相，流量1.0 ml/min。 結(jié)果 建立了HPLC法測(cè)定止咳定喘丸中苦杏仁苷的含量，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9995），平均回收率為99.03%，RSD=2.25%（n=6）。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于止咳平喘丸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] HPLC；止咳平喘丸；苦杏仁苷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）02（a）-0007-03

止咳平喘丸由苦杏仁（炒）、麻黃、石膏、紫蘇子（炒）、厚樸（姜制）、陳皮、罌粟殼（蜜炙）、甘草、茶葉等中藥材加工制成的復(fù)方純中藥制劑[1]，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第三冊(cè)》[2]。功能主治：清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。該藥原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，對(duì)其產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量無(wú)法控制。為控制止咳平喘丸的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法擬建立止咳平喘丸的質(zhì)量控制方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供方法，為定量指標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀（包括LC-2010型紫外檢測(cè)器）；LC Solution色譜工作站。

1.2 試劑與試藥

乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110820-200403）；止咳定喘丸（東芝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130203、130303、130403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（8∶92）；柱溫：30℃；體積流量：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)207 nm；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)：按苦杏仁苷計(jì)算應(yīng)不低于7000，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取苦杏仁苷對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含80 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末3.5 g，精密稱(chēng)定，置塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液 按處方及工藝制備不含苦杏仁的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法學(xué)考察陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果色譜圖中在苦杏仁苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近未檢出干擾峰（圖1）。

圖1 止咳定喘丸HPLC色譜圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y=117 632X-347 713，r=0.9995。結(jié)果表明，苦杏仁苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.0824～2.0600 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD=0.18%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，分別依法處理后測(cè)定。結(jié)果RSD=0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品溶液，在室溫條件下放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值RSD=0.78%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的供試品（批號(hào)：130203，苦杏仁苷含量為3.28 mg/g）6份，每份0.5 g，精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液（0.1950 mg/ml）2 ml，按供試品溶液方法制備，依法測(cè)定含量并計(jì)算回收率（表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量的測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液方法制備，分別進(jìn)樣10 μl，依法測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中苦杏仁苷的含量（表2）。

表2 樣品中苦杏仁苷的測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，苦杏仁苷在207 nm處有最大吸收，選用207 nm作檢測(cè)波長(zhǎng)，苦杏仁苷峰有最大峰面積，其他組分在此無(wú)干擾吸收。

苦杏仁苷的含量測(cè)定方法現(xiàn)多用HPLC法[3]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾按照參考文獻(xiàn)，用各種比例的甲醇-水、乙腈-水作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性太差[4-5]，無(wú)法檢測(cè)，且出現(xiàn)雙齒峰，改用乙腈-水后，得到單峰，穩(wěn)定性明顯改善，且靈敏度也有所提高，苦杏仁苷色譜峰基本上達(dá)到了基線(xiàn)分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終建立了適合本品的含量測(cè)定方法，流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%磷酸（8∶92）。

綜合考慮提取分離中藥有效成分常用的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以甲醇為溶劑，由于溶劑浸提法、回流提取法和索式提取法提取時(shí)間較長(zhǎng)，超聲提取法提取時(shí)間短，且無(wú)其他組分峰干擾，因此選擇超聲提取法作為止咳平喘丸中苦杏仁苷的提取方法[6-7]。

經(jīng)筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在氣候變化明顯的季節(jié)，尤其是秋冬季節(jié)，咳嗽氣喘的患者很多。此藥功能主治為清熱宣肺，止咳平喘。用于咳嗽氣喘，久咳不止。用途廣泛且有一定的市場(chǎng)占有率，但原標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)其性狀和檢查項(xiàng)確定了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他檢定方法，筆者認(rèn)為本研究闡述的檢驗(yàn)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、陰性對(duì)照無(wú)干擾、方法可靠，使止咳定喘丸原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到充實(shí)和完善[8-9]，更能準(zhǔn)確、有效地控制止咳定喘丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：林利利）