缺氧誘導因子及相關靶基因與卒中的關系研究進展

諶金花，羅永杰

缺氧誘導因子（HIF-1）是受控于氧濃度變化的一個至關重要的轉錄因子。在腦卒后HIF-1表達，與其下游靶基因的缺氧反應元件結合，調節其表達，介導機體的缺氧反應。本文對HIF-1及其重要靶基因（血管生長因子，熱休克蛋白）在急性腦卒中的表達及臨床意義進行綜述。

1 HIF-1及其靶基因的結構

1.1 HIF-1 的結構 HIF-1 是一種DNA 結合蛋白，由α、β 兩個亞基組成，以異源二聚體的形式存在，α亞基位于胞質中，其濃度水平隨著低氧水平的增加而呈指數增加，β 亞基位于核中，其表達相對保持恒定。HIF-α家族包括三個成員：HIF-1α、HIF-2α（也叫做內皮PAS 區域蛋白-1,EPAS-1）和HIF-3α,后兩者有更嚴格的組織表達。HIF-1α則為HIF-1所特有，既是HIF-1的調節亞基又是其活性亞基，其調節亞基包括兩個重要的結構域:氧依賴降解結構域和C 末端轉錄激活結構域以及內在激活結構域［1］。

1.2 HIF-1相關靶基因的結構 HIF-1α表達后，與其下游靶基因的缺氧反應元件結合，調節其表達，介導機體的缺氧反應，在缺氧誘導的基因表達中發揮關鍵作用。目前已確認HIF途徑直接激活超過70種基因,HIF 誘導的蛋白表達主要幫助缺氧細胞的代謝和生存需要。根據功能不同，這些靶基因分以下幾類：（1）作用于血管舒縮的控制，如：腎上腺髓質素（AM）、一氧化氮合成酶（NOS）；（2）作用于血管的生成，如：內皮素1（ET1）、血管內皮生長因子（VEGF）、FLT1（VEGF受體1）；（3）作用于鐵代謝,如：運鐵蛋白受體、血漿銅藍蛋白；（4）作用于紅細胞生成，如：促紅細胞生成素（EPO）；（5）作用于細胞分化/細胞循環控制，如：P21（WAF1/CIP1）、類胰島素生長因子2（IGF2）I、GFBP1、IGFBP2、IGFBP3；（6）作用于細胞死亡，如：NIP3、NIX；（7）作用于能量代謝,如：葡萄糖載體1和3（GLU1、GLU3）、脯氨酰4 羥化酶a1、磷酸果糖激酶L乳酸脫氫酶A、醛縮酶A和C、丙酮酸鹽激酶M、烯醇酶1、己糖激酶1和2、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）；（8）作用于轉錄，如：DEC1 和ETS1、ID2、CITED2/p35srj；（9）作用于凋亡，如：NIP3、BNIP3、Noxa、Mcl1；（10）作用于應激，如：熱休克蛋白70（HSP70）;（11）其他，如：纖溶酶原激活阻滯劑1（PAI1）、轉換生長因子3（TGF3）、血紅素加氧酶1、腺苷酸激酶3、磷酸甘油酸鹽激酶1、碳脫水酶9、RTP801、PHD2、PHD3。其中血管內皮生長因子（VEGF）是一種多樣多功能的生長因子，具有四大生物學特性：增加血管滲透性、促進血管生成、促進內皮細胞增值、保護神經細胞。而熱休克蛋白70（HSP70）是一種在缺氧缺血等損傷后產生的具有高度保守性的應激蛋白，能使細胞對損害的耐受能力增強。綜上所述二者在缺氧缺血損傷后，均具有保護作用。

VEGF是一種血管生長因子，在VEGF家族成員中VEGF是最強的調節血管生長因子。VEGF家族有以下幾個成員：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長因子（PLGF）。它們雖然有相似的結構，但他們有著不同的生理和生物學特性，因為它們與三個特定的酪氨酸激酶受體（VEGF-R1、VEGF-R2和VEGF-R3）不同的相互作用決定的。

熱休克蛋白根據不同的分子質量，分不同的家族：HSP100，HSP90，HSP70，HSP60，HSP40 和小HSP家族。其中最保守的是熱休克蛋白70 家族［2］。有研究證實熱休克蛋白存在于多種類型的細胞，包括神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞。熱休克蛋白70由兩個主要的功能區域組成：N-末端和C-末端結構。其N-末端的核苷酸結合域（NBD）為45 kDa，通過與未折疊蛋白和合成肽結合，可以刺激很弱的ATP酶活性；與底物結合的C-末端結構域（SBD），它進一步細分成β-夾心的為15 kDa的亞區和C-末端α-螺旋亞區。熱休克蛋白在他們的促進者中有熱休克元素，他們通過熱休克轉錄因子（HSF，一個家族的轉錄因子）的結合和激活，在熱沖擊或壓力后啟動熱休克轉錄［3］。HSF 通常與靜息細胞中的熱休克蛋白90 結合。在異常蛋白質的存在下，熱休克蛋白90（Hsp90）與HSF解離，然后異常蛋白質結合從而被激活。一旦熱休克蛋白70 被激活，在和其他的蛋白陪伴分子協同下，與變性蛋白結合，以防止蛋白質進一步的變性［4］。熱休克蛋白在細胞缺氧缺血表達增加，它既是細胞受損的標志,又是神經保護因子,對神經細胞的損傷起著重要的保護作用。

2 HIF-1以及相關靶基因在缺血性卒中的表達及意義

2.1 腦缺血后HIF-1α的表達 HIF-1α在不同的腦損傷的實驗模型以及不同的年齡中，其表達時間不一樣。有實驗發現HIF-1α在成年人的局灶性腦缺血后7.5h后表達［5］，而在成人全腦缺血模型中96h 后表達［6］。全身缺氧，不管其持續時間（1，3 或6h），大鼠大腦的HIF-1 核的含量增加［7］。心臟驟停復蘇后1h 的大鼠大腦皮質，HIF-1 顯著增加，持續升高超過12h［8］。更近的研究呈雙相中風后，HIF-1的激活歷時長達10d［9］。

2.2 腦缺血后HIF-1 以及相關靶基因表達 在腦缺氧和缺血時，通過轉錄活化缺氧誘導因子（HIF-1 和HIF-2）從而誘導血管內皮生長因子表達。有研究表明在局部缺血梗死3d 后，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子受體-2（VEGFR-2）的神經細胞在皮質區有表達，說明二者與梗死周圍神經保護作用有關。在一個永久性局灶性腦缺血模型中，早在缺血發作后6h，VEGF 基因在半影區表達增加，導致在大腦中動脈閉塞后48 h 內缺血區域的新血管生長［10］。Ryu 等［11］的實驗表明：血漿中的VEGF 在所有的卒中亞型（心源性卒中、大動脈粥樣硬化性卒中、其它原因引發的卒中、小動脈閉塞性卒中和原因不明的卒中）中均增加，并且在所有卒中亞型中，VEGF 的增加持續表達3個月。VEGF對缺血性腦卒中的整體影響是復雜的，這可能與缺血的強度，持續的時間和側支循環的建立有關。在缺血性腦血管疾病中，VEGF起到一種急性神經保護作用，作用于新的神經元的存活和新生血管的生長。這一點成為臨床上潛在的應用點，我們可以通過多種機制，通過調節VEGF改善中風后的組織并且產生有用的功能。

熱休克蛋白70 在各種大腦損傷后會產生，如缺血、缺氧、癲癇、外傷。內源性熱休克蛋白70 在腦缺血后大約4～6h后表達和直到缺血后24h后缺血達高峰；與此相反，外源性缺血后21/4h 和3h 表達；有人假設在腦缺血的更早時間（如1～2h）給予重組熱休克蛋白70，可以提供保護作用［12］。局灶性腦缺血后，HSP70 主要在梗死區域內的血管和小膠質細胞中和在梗死區域以外的神經膠質細胞和神經元中表達［13］。因此，在神經細胞中HSP70表達可以被看作一種定義半暗帶的蛋白質變性的分子。

有研究發現在腦缺血中的梗死灶周圍的散在神經膠質中存在HSP70 染色夾雜物［14］。這些熱休克蛋白70染色的神經膠質夾雜物的形成可能依賴于腦缺血的嚴重程度和持續時間。在局部缺血后檢測到兩種有活性的小膠質細胞：有活性的HSP70陽性的小膠質細胞和有活性的HSP70 陰性的小膠質細胞［14］。而后者帶有一種“極化的”和桿狀的結構，可以促進梗死的形成，并代表有活性的小膠質細胞在梗死灶中遷移。在一些有活性的小膠質細胞中的HSP70 可能通過抑制炎癥轉錄因子和細胞核因子-κB而抑制炎癥。

2.3 腦缺血后HIF-1α表達意義 卒中后缺血性腦損傷是一個動態的過程，特別是在半影區，這個過程包括幾個事件如氧化應激，細胞死亡，炎癥，以及激活內源性的適應性和再生機制。許多這些進程發生在轉錄水平上的規例，涉及的協同激活各種轉錄因子，包括缺氧誘導因子（HIF）。雖然HIF-1的作用在缺血半暗帶仍是未知，HIF-1 的活性和缺血半暗帶區域之間有很強的相關性。在大腦中腦動脈閉塞后引起的短暫的局灶性腦缺血小鼠模型中，使用紅外熒光標記的融合蛋白（POH-N）標記HIF 活躍的地區并成像［15］。結果表明，缺血性腦損傷后POH-N 標記的HIF 在體內具有監測作用和藥物輸送作用。

然而HIF-1 在缺血性腦病中的作用仍有爭議。一方面，HIF-1 調節促進細胞適應低氧環境廣泛的基因的表達。它的目標包括基因編碼分子參與紅血球生成，細胞增殖及能量代謝。這些功能可能有助于腦缺血神經元存活。神經元特異性敲除HIF-1α增加了組織的損傷和降低大腦中動脈閉塞的小鼠的成活率［9］。另一方面，一些研究報道了在腦缺血中的HIF-1相反的作用。Helton 等的研究結果證明消除大腦中的HIF-1能改善成年大鼠神經系統的細胞凋亡［16］。黃原酸鹽通過抑制HIF-1α的表達以保護大腦的缺血損傷，抑制多余的血管內皮生長因子的表達，以避免血腦屏障破壞和通過BNIP3途徑抑制神經細胞凋亡［17］。HIF-1α的siRNA通過抑制HIF-1α，及其下游的血管內皮生長因子和其它細胞凋亡相關蛋白如p53 和Caspase-3 在體內可保護缺血-再灌注損傷的神經元，并可能在治療早期缺血性腦卒中具有潛力［18］。臨床上有許多實驗證明，抑制HIF-1α及其下游基因可減少腦梗死的出血性轉換和改善局灶性腦缺血后神經功能缺損。總之，在缺血性神經細胞的結局中，HIF-1起著重要的作用。HIF-1參與細胞對缺血損害的反應，具有雙刃劍效應。這的種效應可能取決于細胞損害的嚴重程度。了解這一機制有助于更好的理解其保護的積極作用和促進凋亡的消極作用，有助于引導我們去尋求如何應用其保護作用和減少其消極作用。

2.4 腦缺血后HIF-1α及其靶基因的表達的意義 VEGF的神經血管保護作用：（1）血管內皮生長因子的保護作用與抑制caspase-3活性有關，在外源性給予VEGF的治療中和體內實驗中，均表明VEGF通過抑制細胞死亡途徑的執行而起保護作用；（2）VEGF 可作用于神經元微導管的內容物，在神經細胞的增長、穩定和成熟中起著重要作用［19］，從而對大腦的修復和重生起著重要的作用；（3）VEGF誘導NO從血管內皮細胞上釋放以及通過軸索的生成和提高神經元的存活而直接起到神經保護效應［20］;（4）VEGF通過抑制谷氨酸和N-甲基-D-天門冬氨酸的毒性從而阻止海馬神經元的死亡，以及通過刪除VEGF啟動子中的缺氧元反應元件導致大鼠的運動神經元的衰退［21］;（5）血管內皮生長因子已被當作一種促進神經發生的因子應用于成人大腦中，這種保護作用是其通過提供神經前體增值和分化的血管微環境而達到的，也通過促進內皮細胞釋放腦源性神經營養因子而起作用，還作用于神經前體的有絲分裂。

Hsp70 蛋白在大腦缺血后的神經保護作用和以下幾點有關：（1）可能部分與蛋白質的重折疊有關,在這個過程中HSP70 通過下游的細胞色素c 和上游的casase-3而起抗凋亡作用,通過保存能量的作用，避免損害線粒體的新陳代謝;熱休克蛋白70 蛋白的N-末端部是必不可少的ATP-結合部，而C-末端的結合肽，是熱休克蛋白70的抗凋亡部分［22］；（2）HSP70可能通過結合細胞凋亡誘導因子（AIF）和caspase-9的前體/抗惡性貧血因子（APAF），減少下游事件，而起保護作用［23］；（3）通過抑制蛋白質聚集從而減少細胞的凋亡和壞死，以及通過阻止NF-kB的活化以及與NF-kB相互作用的下游炎癥因子的表達而減少炎癥［24］。

3 HIF-1α在腦出血中的表達和意義

腦出血后引起的腦缺血癥是可變的，往往是暫時的。在腦出血的血腫周圍有一過性的血流量減少。即使低灌注可能不足以引起缺血性損傷，但缺氧仍可引起HIF-1α的表達。腦出血早期，血腫周邊腦組織中HIF-1α蛋白表達的陽性率較低，此后逐漸增加。HIF-1α主要表達于神經細胞胞核，胞質中也有表達，其中胞核染色陽性的細胞多聚集在靠近血腫邊緣的壞死區及血管相對稀少的區域，一般認為距離功能血管100～200μm以外區域即處于缺血環境中。Jiang 等［25］報道，腦出血造模后4h HIF-1α蛋白水平開始升高，第3d達到高峰，到第7d 時低于第1d 的水平，且第3d 的高峰期可以被水蛭素阻斷。劉慶新等［26］研究高血壓腦出血后4h血腫周圍腦組織可見散在HIF-1α表達，24～48h 達到高峰，49～72hHIF-1α持續高表達。Zhu 等［27］發現，出血量＞60ml 的HIF-1α的表達，陽性率（88.9%）明顯高于那些與出血量介乎30～45ml 或45～60ml（P ＜0.05）。

綜上所述，HIF-1α的表達與出血的時間和出血的量密切相關。HIF-1α表達和血腫大小相關，這可能是血腫的占位效應、血液活性物質的釋放、再灌注“無復流現象”、腦血流自動調節障礙等有關。隨著出血時間的延長，血腫中的白細胞本身或刺激神經細胞產生的白細胞介素、腫瘤壞死因子α等可通過核因子κB途徑上調HIF-1α的表達［28］和紅細胞裂解物也可使HIF-1α的表達增加。干擾素α也可使HIF-1α轉錄增加。然而，缺氧以外的其他因素也有可能導致腦出血后HIF-1α上調。例如，凝血酶能誘導體外培養的平滑肌細HIF-1α上調［29］。

4 HIF-1以及相關靶基因對缺血后腦水腫的影響

卒中后腦水腫具有逐漸增加的發病率和死亡率，成為臨床上關鍵問題。在腦缺血損傷后數小時內，早期的病理反應如血管通透性增加和腦水腫形成會被觸發。有研究表明，VEG 在因血腦屏障破環導致的不同形式的腦損害的早期階段，發揮了關鍵作用。在再灌注的大鼠大腦中動脈閉塞90min 后的大腦表面上，局部應用VEGF，明顯減少梗死體積和水腫，以及降低了神經元的損傷［30］。另一方面，在缺血早期（1h）內全身使用VEGF，導致血腦屏障滲透性增加致急性腦水腫，同時增加了出血轉化的風險［31］。局部組織VEGF 濃度精確地決定：新生血管是否發生，異常血管系統是否形成。這提示在正確的部位應用適量的血管內皮生長因子的重要性。全身的血管內皮生長因子的應用的有益效果，從另一方面來說是依賴于治療的時間點。已有的數據表明，在正確時間和適量地應用VEGF 是至關重要的［32］。HIF-1α作為大腦的甘油濃度和腦水腫上游調節器，其分子途徑涉及水通道蛋白（AQP-4 和AQP-9）,可以設想藥理封鎖這條途徑可以為中風患者提供腦水腫新的治療策略［32］。

5 HIF-1α與缺血性腦病的治療

維生素E 誘導缺氧誘導因子-1α及其靶基因，包括血管內皮生長因子（VEGF）和血紅素氧化酶-1的表達，從而減輕大腦缺血損害［33］。依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，在臨床上用于急性腦梗塞患者。研究表明，依達拉奉通過抑制HIF-1α信號通路誘導大鼠腦缺血再灌注損傷后的腦室管膜下區神經再生［34］。在動物實驗的大腦中動脈閉塞導致的腦缺血中，葛根素是一種有效的神經保護劑。此效應可能是介導的，至少部分通過抑制HIF-1α和TNF-α的激活［35］。高壓氧的預處理減少局灶性腦缺血后的腦損傷，這可能是通過上調HIF-1α及其靶基因EPO，從而減少神經元的缺血損傷以及凋亡［36］。Anan M 等［37］在HIF-1α，HIF-2α和環氧合酶2裸DNA誘導的大鼠血管生成的間接旁路模型中，用HIF-1α的DNA處理的10天組織學切片顯示一個發達的側支循環（P ＜0.05）以及梗死體積減少和對照的DNA 處理比較有統計學意義（P ＜0.01）。這些結果說明了通過HIF-1 的途徑建立側支循環來治療腦缺血的一種新穎的方法的可能性，通過轉錄調控的策略來間接的促進新生血管的形成，改善卒中后局灶的缺血病變。

6 結語

HIF-1 及其相關靶基因是重要的轉錄調控因子,在缺氧缺血性腦血管疾病中和缺血性腦病的治療中都扮演重要的角色。腦梗死或腦出血后病灶周圍的缺血缺氧反應，誘導HIF-1 以及其相關靶基因的表達，從而直接或間接的起到保護作用，另一方面也產生一些負面作用。現目前關于HIF-1 以及其相關靶基因的研究，仍處于動物實驗階段，這提示我們在以后的臨床試驗中如何避免它們的消極作用更好的應用它們的積極作用是及其重要的。

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