骨髓間充質干細胞治療缺血性腦卒中的研究與應用

謝 帆 綜述，湯永紅 審校

在過去的50 年里，關于缺血性腦卒中的治療進行了大量臨床前和臨床試驗，很少有藥物是有效的保護或修復受損的中樞神經系統。然而，近10 年的研究都強烈推薦，細胞移植治療各種中樞神經系統疾病（包括腦卒中）可能促進功能恢復。多種細胞類型研究表明，作為細胞源植入中樞神經系統疾病的動物模型后，包括胚胎干細胞，神經干細胞，臍帶血單核細胞，誘導式多能干細胞（iPS細胞）和BMSC，可以在缺血后組織中生存，減輕神經元損傷，修復神經功能［1-3］。其中，BMSC 可能最具潛力，因為其可以從患者體內獲得并不造成倫理或免疫困難。BMSC 是一種多潛能的非造血干細胞，具有自我增值、多系分化、免疫調節、歸巢擴散能力，能分化成脂肪、骨、軟骨，也可以分化為于胚胎無關的組織，包括神經細胞［4］。植入人工支架于受損部位能支持BMSC遷移，促進缺血性腦的修復和再生［5］。神經營養因子可大大提高BMSC 的遷移或到支架的侵襲，在缺血性腦損傷慢性期提供以后的再生潛力［6］。特別是粒細胞集落刺激因子（GCSF），可通過促進BMC遷移至缺血性腦加強神經和血管生成［7］。BMSC移植與其他先進技術科學、合理的融合以治療缺血性腦卒中，為治療提供新方向，為卒中患者帶來新希望。

1 骨髓間充質干細胞治療缺血性腦卒中的基礎科學研究

1.1 BMSC 的神經再生、修復作用越來越多的證據表明，移植的BMSC 向受損的中樞神經系統組織遷移，促進腦梗死后運動功能的恢復。最近的研究表明，BMSC還能改善由于慢性腦缺血導致的認知功能障礙［8］。現在，BMSC被認為是通過分化成神經細胞和產生各種細胞因子或生長因子，搶救和修復受損的中樞神經系統；也可能通過釋放一些神經保護或神經營養因子和抑制炎癥反應來支持宿主神經細胞的生存［9-10］。在一定實驗條件下，他們可以修改自己的基因表達譜，分化成神經元細胞［11］。因此，BMSC 本身能表達相關基因的神經元和神經膠質細胞。當BMSC與公開的神經元興奮性氨基酸（谷氨酸）共同培養時，能顯著地增加可溶性神經保護因子的釋放，如神經生長因子和腦源性神經營養因子，修復神經細胞損傷［12］。BMSC能顯著促進背根神經節的軸突生長,明顯促進神經元突觸在大腦和脊髓的延伸，增強梗塞周圍區域的幸存皮層神經元的軸突發芽［13］。Chiba等［14］提出，BMSC 在中樞神經系統表現出旁觀者機制，通過釋放營養分子，拯救神經元，并促進當地的神經前體細胞增殖和成熟，它們對小膠質細胞和星形膠質細胞可以有抗炎和抗增殖作用，保護神經微環境。根據這些觀察，BMSC可以通過多種機制由異質細胞群保護和修復中樞神經系統損傷。

1.2 BMSC 的趨化、增殖能力BMSC 在腦內移植后到達梗死腦依然有強大的增殖能力［15］。移植的BMSC 通過趨化因子系統向梗死組織遷移，如單核細胞趨化蛋白-1、基質細胞衍生因子-α、肝細胞生長因子［16］。大量研究證明，在梗塞周圍區移植的BMSC 為神經元、星形膠質細胞和血管內皮細胞表達特定的蛋白質［17-18］。最近的一項研究表明，移植的BMSC能表達γ-氨基丁酸（GABA）受體和增強與梗死周圍區的結合潛力［19］。

2 骨髓間充質干細胞治療缺血性腦卒中的臨床試驗

2.1 BMSC 的臨床試驗現狀 如上所述，基礎實驗的觀測是令人鼓舞的。針對缺血性腦卒中患者的BMSC 移植的一些臨床試驗也已經啟動。Bussolino F 等［20］為50例缺血性腦卒中后5～9 周的嚴重神經功能缺損病癥，靜脈注射自體BMSC，得出結論，自體BMSC輸注是一個可行和安全的治療方法，可促進功能恢復；Cai J等［21］為12例缺血性腦卒中后36～133天的患者靜脈移植BMSC；Lee JS等［22］完成了一項開放式觀察52例缺血性腦卒中患者的雙盲臨床試驗，并隨訪他們長達5 年。他們的結論是，靜脈移植自體BMSC 治療缺血性腦卒中可能是一個安全和有效的策略。但是，我們應該清楚地提醒，沒有任何臨床試驗證明細胞治療的臨床意義，包括BMSC的移植。

2.2 BMSC 的臨床試驗進展及問題 有許多變數可能會影響BMSC 移植在臨床中的療效。其中包括供體細胞（安全性、自體或同種異體、前體內細胞的擴展），患者因素（年齡和卒中類型），治療因素（發病間隔時間，臨床治療路徑和細胞劑量），驗證因素（神經系統的評估和成像）［23］。現在是時候為發展神經保護藥物從臨床前研究中的問題吸取經驗教訓了。

首先，同種異體細胞被允許在發病后24 小時內使用，但需強制長期免疫抑制劑藥物治療［24］。患者自體BMSC作為供體細胞是理想的，但他們需要幾個星期在前體內擴增。因此，建立一個可行的協議，安全、迅速擴增BMSC 是關鍵。BMSC 在大多數動物實驗和臨床試驗中被包括胎牛血清的培養基培養。然而，胎牛血清攜帶朊病毒，存在病毒、或人畜共患病污染的潛在風險。雖然，自體血清可用于擴增BMSC，但可能需要大量的血清。最近，人類血小板裂解液已被證實可作為BMSC 擴增培養基的替代品。血小板裂解液中含介質，能擴增人類BMSC 并保留他們的遷移、存活和分化能力，立體定向移植到梗死腦時顯著促進功能恢復［25］。因此，血小板裂解液可能是一個有臨床價值的和安全的替代胎牛血清擴增BMSC 的方法。

第二，在大多數動物研究中BMSC于腦卒中造模后24 小時或7 天之內移植，而在之前的臨床試驗中他們通常是在發病后數周（甚至是幾個月）后移植。因此，動物實驗和臨床試驗的治療協議之間存在著相當大的差距，這可能與臨床前試驗不足相關。粒細胞集落刺激因子（G-CSFs）可能是有用的，一定濃度的G-CSFs 可顯著提高BMSC 的增殖能力，通過調節細胞周期，上調其產生的神經生長因子、肝細胞生長因子和基質細胞衍生因子-α［26］。因此，G-CSFs 可以加快治療缺血性腦卒中細胞的擴增和縮短發病至移植治療之間的時間間隔。眾所周知，各種成體干細胞，包括BMSC 的老化會明顯降低自我更新和分化能力。這一事實將對BMSC 移植治療缺血性腦卒中的療效產生顯著影響。因為大多數缺血性腦卒中患者年事已高。近期有研究表明，G-CSF在老年動物中也能促進BMSC的增殖能力和神經營養因子的釋放［27］。

第三，BMSC可以直接移植，或者靜脈、動脈內或鞘內注射。直接（顱內）注射使供體細胞最快捷地在受損組織中定植。靜脈內或鞘內注射移植是有吸引力的，因為它是一種非侵入性的、安全的技術，但有報道稱相比直接移植它將導致更少的細胞遷移和功能恢復［28］。另外，動脈內注射BMSC非侵入性地交付給受損的中樞神經系統可能是有價值的［29］。因此，需要制定最佳的移植技術，最大限度的安全和高效的服務患者。值得關注的是，組織工程技術可以提供另一個途徑來傳遞細胞。在其他器官如骨骼、軟骨、心臟和皮膚，可降解的生物材料已經被接受作為一種有價值的“腳手架”來修復和穩定移植的細胞。然而，只有少數研究表示支架對細胞移植治療中樞神經系統疾病有效。最近一項研究表明，纖維基質可提高BMSC的生存和遷移能力，對于缺血性腦卒中的治療是一個有用的材料［30］。熱可逆凝膠聚合物水凝膠為BMSC 提供一個合適的環境，也可能是一個候選支架［31］。然而，還沒有臨床試驗進行這種技術在細胞治療缺血性腦卒中療效的檢驗。

最后，移植細胞在宿主中樞神經系統連續和非侵入性的示蹤方法，這將是發展必不可缺的技術。磁共振成像、核醫學成像和光學成像為主要候選方式。供體細胞可以在磁共振成像識別超順磁性氧化鐵劑標記［32］。磁共振成像可以直觀完整、不透明的有機體，在三維空間具有良好的空間分辨率，但因為靈敏度低需要成像時間長，因此減緩數據采集。核成像通過放射性示蹤劑標記發現移植的細胞。Tian F 等［33］通過99m TC-hexamethylpropylene（HMPAO）標記BMSC，并通過導管將其注射到缺血性腦卒中患者，移植的細胞通過單光子發射計算機斷層掃描展現。核成像可以檢測目標，具有高靈敏度，但由于臨床上可用的示蹤劑的半衰期相對較短，長期監視供體細胞有困難。另外，光學成像技術也可作為移植的BMSC在受損的中樞神經系統可視化的未來技術。量子點發射近紅外熒光，具有較長的波長（800 納米），可以很容易地穿透生物活體組織。近期的研究表明，當量子點標記的BMSC 移植到大鼠梗死腦組織，至少8 周后，仍可以通過體內熒光成像在頭骨和頭皮下清晰可見［34］。成像技術在BMSC 移植對宿主大腦功能影響的評估將是有臨床價值的。

3 展 望

上文總結了BMSC 目前的基礎科學進展和早期先進的臨床應用。最近的研究已經強烈建議BMSC移植治療缺血性腦卒中。但BMSC 的作用機制及臨床應用設置等方面仍有待進一步研究。最新研究發現，神經細胞和血管成分之間一個重要的互動組件如神經血管單元，成為缺血性腦卒中潛在的治療目標［35］。近期指出兩個除了壞死和凋亡之外的神經細胞死亡機制：誘導細胞自噬和轉錄抑制非典型死亡，為卒中的治療提供新的方向［36］。神經血管單元和額外的細胞死亡機制，對干細胞療法的潛在療效及研究方向的影響是未來研究的主題。而且，進一步的研究將為臨床設置建立一個科學的行之有效的策略。此外，干細胞治療與其他技術如血管再通操作相結合，將為患者提供額外的福利。

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