心臟干細胞基礎研究和臨床應用回顧與展望

段茂林 綜述，廖 斌 審校

CSCs對心臟干細胞（CardiacStemCells，CSCs）的發現打破了傳統對心臟是“終分化不可再生”器官的認識。經過大量實驗研究，目前已經對CSCs 有了初步的認識，包括CSCs 的形態特征，遷移性，具有代表性的細胞標記物，以及CSCs的分化潛能。心臟，從來都被認為是一個終分化的器官，臨床上一些疾病，例如心肌梗死、心力衰竭、擴張性心肌病、病竇綜合癥等造成的心肌損傷都是不可逆的，臨床治療中仍不能找到有效的方法“獲取”新的心肌來代替受損的心肌。2002年Hierlihy1等從小鼠心肌細胞中分離出一類具有干細胞生物行為特征的細胞，命名曰“邊緣細胞群”（SidePopulation,SP），這類細胞有向心肌細胞分化的潛能，證明了心臟并不是一個終分化的器官，心臟仍然具有再生能力。CSCs 越來越多的研究，不斷支持CSCs 存在于心臟的結論，并且證明了其具有自我增殖和分化成心臟各種細胞成分的潛能，CSCs 逐漸走進了人們的視野，成為組織再生工程研究的熱點對象。

1 CSCs的分類

CSCs 被證明存在以來，就一直成為干細胞研究的熱點對象。已經認識到CSCs并非是一類單一特性的干細胞，而是一群處于不同分化階段、并具有向心臟各類細胞（心肌細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等）分化潛能的譜系細胞群體2,3。CSCs位于心臟干細胞巢（CardiacStemCellsniches）中，處于多向分化程度，并通過結構和功能蛋白與其周圍的支持細胞（surpportingcells）相連接2,3，因此，真正意義的CSCs應該叫做心臟干細胞譜系（cardiacstem cellsculture）。通過尋找CSCs的特有細胞表面標記物來區分它們，是目前最通用、最有效也是最具有可行性的方法。對于CSCs 的不斷研究使人們發現，很多存在于其他類型干細胞表面的標記物也出現在CSCs 表面，因此借用這些細胞表面標記物可以使CSCs得以初步篩分，但由于這一系列標記物并非CSCs所特有，而且分離和純化CSCs也缺乏有效方法，這種方法對CSCs的分類是否有意義，尚需進一步驗證。目前，人們在CSCs 表面發現的干細胞標記物有C-kit，MDR,Sca-1,Islt-1以及一些比較特殊的CSCs團體結構。

1.1 C-kit+CSCs C-kit，干細胞因子，在許多成體干細胞都有表達。C-kit 是目前研究得最徹底的CSCs標記物。2003年，Antonio4等利用流式細胞儀首次從小鼠心臟中分離出了Lin-C-kit+細胞，證明了這類細胞具有克隆、自我更新以及多能分化潛能，也通過熒光染色的方法證明了這類細胞可以產生心臟結構譜系標記物，如GATA-4、Nkx-2.5、MEF2C，同時指出C-kit并不表達于造血細胞系；2010年，HeJQ5等指出，C-kit最先出現在造血譜系細胞，但在造血細胞分化時消失；2005年Konrad6等在對急性心肌梗死病人及慢性缺血性心臟病病人的研究中發現，在急性心肌梗死模型中，梗死區有一群“快速反應”的CSCs，它們可以分化出心肌細胞、平滑肌細胞，源于冠脈的干細胞可以分化出內皮細胞，并且這些CSCs 中約60%是C-kit+-MDR+-Sca-1+譜系細胞，單純表達C-kit+的CSCs 占12%左右，而慢性缺血性心臟病CSCs 的生長卻很不明顯；近來的實驗也已證明，體外已經成功培養出可以穩定表達C-kit 的人CSCs5。以上證據充分表明，如果可以在體外培養出這樣的干細胞、保持其分化增殖能力，并將其移植回心肌梗塞患者心臟內，使其增殖分化出新的心肌細胞來替代受損的心肌，對于恢復患者心功能有可能會有效。

1.2 MDR+CSCs MDR（multi-drug resistance）多耐藥。在各種人體組織都有發現，其特點是能夠排出代謝性標記物如煙酸己可堿333427，這個特性需要依賴P-糖蛋白或轉運蛋白的表達，如ABCG28,而P-糖蛋白或轉運蛋白則是MDR 基因編碼產生9。MDR+CSCs是一種特殊類型的CSCs，有實驗1,10在成人心肌中分離出了側群細胞（side populationcell，SPcell），并且證明了這類細胞可以表達MDR 基因，產生ABCG2,而Oyama10 的實驗證明，表達ABCG2 的SP細胞在心肌中可以分化出心肌細胞，成纖維細胞等，這也證明了SP細胞具有再生能力，但是SP細胞在心臟中含量很低，其對心肌的修復能力效果還有待研究。

1.3 Sca-1+CSCs Sca-1 干細胞抗原1，屬于Ly-6 家族成員之一，最早是以造血干細胞譜系表面抗原被報道11，2004 年Matsuura12 等通過磁珠分離法從成年鼠心臟中分離出Sca-1+CSCs，它們缺乏造血細胞系干細胞的表面特征標記物，他們將分離出的Sca-1+CSCs于體外培養，催產素刺激2 周后，培養出可搏動心肌細胞，并檢測到這些細胞可以表達一系列產生心肌結構蛋白的基因，比如GATA-4，MEF2C等；2012年，Ye-JQ13 等在急性心肌梗死小鼠動物模型的研究中發現，急性心梗后2 周，梗死區產生了許多具有干細胞行為特性的細胞，多為Sca-1+-CD45-亞群細胞，這些細胞可以分化成成纖維細胞、內皮細胞和平滑肌細胞，并且證明了這些細胞是心源性細胞，而非源自骨髓干細胞。

1.4 Islt-1+CSCs Islt 胰島因子，在胚胎和出生后的胎兒，我們都能發現Islt-1+CSCs 的存在，并且相關的研究發現，Islt-1+CSC 似乎對于心臟及大血管的正常發育有重要作用。2003年L.C Chen14等描述了關于Islt-1+CSCs的特征和其對心臟發育的重要性，他們指出Islt-1+CSCs源自第二生心區，參與構成流出道、右心室、右心房及少部分左心室。同時，Islt-1+CSCs 的表達還調控Bmp415 和Wnt 信號通路,這些信號通路的開啟會激活GATA4 和SRF（Serum response factor，血清反應因子）的表達16。

1.5 心外膜干細胞（Epicardium-derived cells,EPDCs）CSCs的另一個來源是心臟外膜，有多組報道指出成人心臟外膜存在內源性的心外膜干細胞，可以衍生出心肌和血管平滑肌17，并且EPDCs 還有誘導產生外膜纖維細胞、冠脈平滑肌細胞及內皮細胞的潛能18,19,20。Madonna 等實驗證明，人EPDCs 注射到有免疫缺陷的小鼠模型心肌，可以提高小鼠心臟EF值，并防止心肌的纖維性重塑21。

1.6 幾種特殊的CSCs形態

1.6.1 心肌球樣細胞群（cardiospheres）2004 年Elisa Messina22等從心肌中分離出一種特殊的具有干細胞特性的細胞群，他們稱之為球體樣細胞（Sphere-Forming Cells），通過免疫檢測，他們發現心肌球樣細胞群表達許多內皮細胞表面標記物KDR，flk-1，CD-31及干細胞表面標記物C-kit，Sca-1，并且證明了這類細胞可以向內皮細胞及心肌細胞分化。

1.6.2 側群細胞 Hierlihy1 等首先從小鼠心肌細胞中分離出一類具有干細胞生物行為特征的細胞，將其命名為邊緣群細胞或者側群細胞（SidePopulation,SP），和新生心肌共培養可以誘導SP 細胞向心肌細胞分化。2002年，Kazumasa等對心臟SP細胞做了較為詳細的闡述23：他們指出心臟SP細胞通常表達Sca1而不表達造血細胞系的相關細胞標記物，如CD34 和CD45。Oyama10 等首次描述了在體的SP 細胞的特性，GFP+新生SP可以向受損的心肌細胞遷移，增殖和分化成新生心肌細胞，修復受損的心肌細胞。與Oyama 研究相類似，Yew Liang24 的研究顯示，Sca+-CD31 SP 細胞在體外可以可以向心肌細胞和內皮細胞分化和增殖，并且，當心肌細胞受損時，Sca+-CD31 SP細胞可以向受損細胞遷移，并且有成血管作用。

目前對CSCs的認識仍然有限，因此對于CSCs的分類還比較混亂，沒有統一的分類方法，有研究指出了以上幾種不同細胞表面標記物的CSCs之間有著很緊密的聯系，Konrad6 的研究表明，急性心梗的病人心肌中可以見到新生的CSCs，其中60%細胞C-kit、MDR、Sca-1 同時表達，而只有很少部分只表達單一一種或兩種表面標記物，同時，有證據顯示25,26上述的某些CSCs 可能只是同一種干細胞的不同亞群，因此表面抗原區分CSCs 的方法雖然是目前分類CSCs的通用方法，但是其可靠性需要進一步論證。

2 離子通道與CSCs

目前，離子通道對于干細胞的影響研究多集中在人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells，HESCs）對象，而非CSCs，少數研究者有過對CSCs的研究，Yi H,27 等在對免疫磁珠方法分離出的小鼠Ckit+細胞離子通道研究中觀察到了三種類型的膜電流：延遲整流鉀電流（IKDR）、內向整流鉀電流（IKir）、容積依賴性氯離子ICl vol，他們指出，離子通道的表達存在異質性，這說明可能處于不同時期的細胞離子通道的表達不一致28。離子通道對CSCs 的作用還不是很清楚，研究也不多，還有比較大的研究空間29。

3 CSCs的臨床應用與展望

雖然對于CSCs 的認識還存在很多不確定和模糊，但應該得到肯定的是CSCs 的臨床應用前景。在治療急性心肌梗死和缺血性心肌病中，CSCs 具有巨大的潛力，美國心臟病協會（AHA）2012 科學會議上公布的缺血性心肌病患者心肌干細胞（CSC）注射小型研究“缺血性心肌病患者干細胞注射”（SCIPIO）試驗的2 年隨訪結果顯示，2 年內，接受“CSCs”注射的治療組LVEF 都有明顯提高，說明CSCs 對于恢復心臟的泵功能確實有效,CSCs 無論在心肌梗死后心肌再生及心功能恢復或者是構建生物起搏器方面都有其不可替代的優勢，有巨大的研究前景和研究價值。雖然CSCs已經被發現多年，但目前人們對于CSCs的認識仍然較少，有很多甚至是空白，比如將骨髓間充質干細胞移植回心臟后，有導致心律失常的報道，CSCs 移植回心臟會不會也有導致心律失常的表現，如何保證CSCs不向腫瘤細胞分化，誘導CSCs培養出的起搏樣細胞是否有時效性，除此之外，值得重點關注的是，新近對于microRNA 的深入研究發現，miRNA 在調控心臟發育方面也起著關鍵性的作用，尤其在心血管譜系細胞的分化中有很重要的作用，比如miRNA290-295 譜系被認為參與了促進ESC 增殖、及干細胞的分化多能性維持的調控30,31；miRNA-302-367譜系通過調節細胞周期來維持ESC的增殖32；有報道指出miR134,miR-296 和miR470 在ESC 分化時處于上調狀態33，miRNA-145 不僅直接靶向抑制多能性因子Oct4,Sox2,and Klf4,還通過其過表達抑制ESC 自我更新，促進不同譜系種類細胞形成34,SK4Ca+激活K+通道對于HESCs向心臟起搏細胞分化具有重要作用35，但是這些都是基于對ESC的研究，CSCs 是否有類似的效果還不得而知，因此這方面的研究空間和可研究性還很大。

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