糖基化處理對綠豆分離蛋白功能特性的影響

王 曉，江連洲，李 楊，王中江，梁 婧，陳 勇

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

糖基化處理對綠豆分離蛋白功能特性的影響

王 曉，江連洲*，李 楊，王中江，梁 婧，陳 勇

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

為探討糖基化處理對綠豆分離蛋白的功能特性影響，通過測定接枝度，紅外光譜分析，以及對溶解性，乳化性和乳化穩(wěn)定性，起泡性和起泡穩(wěn)定性進行了探究。結果表明：相比于麥芽糖，采用葡萄糖與綠豆分離蛋白反應所得產物的接枝度較高，更易于反應；紅外光譜顯示有蛋白和糖的共價復合物生成，且α-螺旋和β-轉角結構含量升高，其他兩種二級結構組成降低；糖基化后的綠豆分離蛋白溶解度得到改善，且葡萄糖優(yōu)于麥芽糖；糖基化后綠豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均得到提高，且麥芽糖效果更好；糖基化后綠豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均得到提高，且葡萄糖效果更明顯。

糖基化，綠豆分離蛋白，接枝度，紅外光譜，功能特性

綠豆在我國資源較豐富，在大部分的地區(qū)都有生產，目前國內的綠豆加工主要以淀粉利用為主，淀粉生產中產生的綠豆蛋白等副產物尚未得到充分利用，其中它的蛋白含量高達19.15%～33.11%，包含各種氨基酸種類，特別是賴氨酸含量豐富，接近在雞蛋中的含量[1]。盡管綠豆蛋白具有一定的功能性質，但其較低的溶解性限制了它在食品生產中的應用，而且其乳化性等性質與某些動物源蛋白質相比有較大差距，因此需要對綠豆蛋白進行改性，以期獲得優(yōu)良的功能特性。

國內外有對綠豆蛋白的研究報道，Adsuale對綠豆分離蛋白營養(yǎng)品質作了全面綜述[1]，曾志紅等對綠豆分離蛋白的功能性質進行初步研究[2]，但對改性綠豆分離蛋白營養(yǎng)品質與功能特性的研究仍非常欠缺。常用的改性方法包括物理改性[3]，化學改性和酶法改性[4]，其中糖基化修飾是一種較為理想的改性方法，具有自發(fā)進行、無需添加化學試劑、加熱即可加速反應等優(yōu)點，可以有效提高蛋白質的功能特性。Sun等將還原糖與乳清蛋白進行糖基化反應后，其功能性質顯著提高[5]。Groubet等將多種還原糖與β-酪蛋白進行反應后，接枝產物的溶解性得到了一定改善[6]。蘇志光等將甘露聚糖與大豆分離蛋白糖基化生成糖蛋白，其溶解性顯著提高[7]。但由于經糖基化處理后許多氨基酸失去了原有功能，是營養(yǎng)流失的主要原因，并且其過程產生了雜環(huán)胺等有害中間產物，產生極大安全隱患，所以產物在應用于食品加工前，應對安全性和營養(yǎng)性進行進一步研究。前人研究了糖基化改性對蛋白質功能特性的影響，但多數都是運用干熱法制備多糖與蛋白復合物而進行研究。本實驗通過測定經濕熱法在不同時間和溫度制得的葡萄糖和麥芽糖與綠豆分離蛋白糖基化產物的溶解性、乳化性等，分析糖基化溫度和時間對其功能性質的影響，為采用糖基化處理提高其功能特性提供理論依據，并尋找出廣泛應用于食品中的高性能食品添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠小豆 黑龍江北大荒集團；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；SDS Sigma公司；TNBS 上海寶曼生物科技有限公司。

JZ7114型粉碎機 上海朝陽微電機廠；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；Allegra64R型臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；TU-1800型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；磁力攪拌器、高速乳化均質機 廣州儀科實驗儀器有限公司；MAGNA-IR560傅立葉變換紅外光譜系統 美國尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆分離蛋白的提取 綠豆經除雜后，采用堿溶酸沉法提取綠豆分離蛋白[8]，提取流程參見圖1。

圖1 綠豆分離蛋白的制備Fig.1 Preparation of mung bean protein isolates

1.2.2 糖基化蛋白的制備 將5g綠豆分離蛋白和10g葡萄糖（10g麥芽糖），混合均勻后，溶于400mL的蒸餾水中，攪拌，用NaOH溶液調節(jié)pH至8并定容至500mL，得到蛋白質濃度為10mg/mL的溶液。將溶液轉移到燒杯中，置于60℃（70℃）水浴中加熱，每隔1h取樣30mL，放于離心管中，用冷水快速冷卻后待測[9]。

1.2.3 接枝度的測定 取125μL的反應液與2.0mL pH為8.2的磷酸緩沖液混合，并加入1.0mL 0.01%的TNBS，使其充分混合，避光條件下50℃水浴加熱30min，加入2.0mL的0.1mmol/L的亞硫酸鈉終止反應，在室溫下放置15min，在相同操作條件下采用蒸餾水代替反應液作為空白對照。用紫外可見分光光度計測定在420nm的吸光值。根據L-亮氨酸含量的標準曲線來確定自由氨基含量[10]。

式中：C0：未反應時自由氨基含量，Ct：反應時間t時自由氨基含量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜檢測 將凍干樣品置于干燥器內充分干燥，稱取樣品1mg，與100mg溴化鉀研磨混勻壓片測定FTIR。在數據采集期間，為了減少水蒸汽IR吸收的干擾，持續(xù)用干燥的N2淋洗測量室。在與樣品測定完全相同的條件下在室溫敞開狀態(tài)收集空氣背景。測定在波數范圍為4000～400cm-1的吸收光譜，分辨率4cm-1，波數精度0.01cm-1，掃描次數64次，環(huán)境溫度25℃。

1.2.5 溶解度的測定 稱取100mg蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌30min，在20℃下12000×g離心20min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比[11]。

1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 取10mL蛋白質反應液與2mL大豆油混合，放入離心管中，在機械乳化機中乳化2min，迅速將乳化液倒入25mL的燒杯中。在距燒杯底部0.5cm處取樣，取50μL的乳化液，迅速與10mL 0.1%的SDS混合，在500nm處測定吸光度，空白對照用0.1%的SDS[12]。

式中，N：稀釋倍數；C：乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度（g/mL）；Φ：乳化液中油的體積分數（L/L）。

1.2.7 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定 稱取1g樣品溶于100mL去離子水，置于500mL量筒中，均質40s，連續(xù)3次共計2min，記錄均質后液面高度為V0（mL），靜置30min后記錄為V30min（mL）[13]。

1.3 數據統計分析

實驗中所有數據都是三次測定的平均值，利用一維方差分析的LSD比較樣品平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應對接枝度的影響

為表征綠豆分離蛋白與還原糖的反應程度，分別測定了綠豆分離蛋白與葡萄糖和麥芽糖反應后接枝度的變化。隨著加熱時間的增加，不同溫度反應體系的接枝度均顯著提高（p＜0.05），且葡萄糖與綠豆分離蛋白的接枝度高于麥芽糖。從圖2可以看出，在240min時，接枝程度最大，其相差也較大，可能是由于在相同質量的情況下，單糖羰基含量更高，增加了羰基和氨基的結合率，有利于反應的進行，跟前人的研究發(fā)現一致，糖基化反應中，糖基的分子質量越大，反應進行的程度越低，而分子質量越小，反應量越大[14]。隨著時間的延長，蛋白質與糖的接枝反應程度增加變緩，這可能因為長時間的蛋白質與糖的發(fā)生接枝反應的同時，蛋白質分子之間出現不同程度的 熱 聚 集[15]，使 得 反 應 體 系 中 的 不 溶 性 組 分 大 大 增加，抑制接枝反應的進行。

圖2 接枝度的變化Fig.2 Changes of the degree of grafting

2.2 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜是一種目前常用的分析蛋白質結構的方法，可靈敏地反映出肽鏈結構的一些變化[16]。經過4h的糖基化反應，確定紅外光譜圖3，表明不同糖基化處理，呈現不同的糖基化程度。在3500～3200cm-1之間的寬峰是O-H和N-H的伸縮振動，說明存在分子間和分子內的氫鍵，3000～2800cm-1的峰是糖類C-H伸縮振動，表明此物質為糖類復合物[17]。

其次選取了紅外光譜的酰胺I帶來分析綠豆蛋白的二級結構組成，采用Peakfit軟件對蛋白質酰胺I帶進行傅立葉變換去卷積，進行二階導數峰擬合，得到 子 峰 數 目 在9 ～13之 間 ，其 殘 差（r2）大 于0.96，確 認峰位歸屬，計算各子峰面積的相對百分含量，測定3次，取平均值。各子峰與二級結構對應關系的指認為 ：1615～1640cm-1和1670～1690cm-1β-折 疊 ；1650 ～1660cm-1為α-螺旋；1640～1650cm-1為無規(guī)則卷曲；1660～1700cm-1為β-轉角[18-19]。如表1所示，通過紅外光譜酰胺I帶分析可知，經糖基化處理后綠豆蛋白的α-螺旋結構含量有所升高，β-折疊結構含量有所降低，β-轉角結構含量小幅升高，無規(guī)卷曲結構含量小幅降低。推測α-螺旋結構含量升高主要是由多肽鏈上羰基（-CO）和氨基（NH-）之間的氫鍵被破壞，蛋白質的聚集使β-折疊結構含量減少，β-轉角比例增加可能是加熱作用下α-螺旋結構內部氫鍵作用被破壞，無規(guī)卷曲結構這種轉變表明蛋白質的結構重組，可能是亞基解離和聚合。

圖3 糖基化產物紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of glycosylation products

表1 糖基化綠豆分離蛋白質酰胺Ⅰ帶擬合結果Table 1 Fitting results of secondary structure of glycosylation protein by amide I band

2.3 糖基化反應對溶解度的影響

不同反應時間反應產物的溶解性分別如圖4所示，隨著糖基化反應時間的延長，溶解度得到改善，不同溫度反應體系的溶解度均顯著提高（p＜0.05），反應2h后趨于平緩，且葡萄糖高于麥芽糖。這與Achouri等[20]的研究結果一致，表明大豆球蛋白（11S）與葡萄糖發(fā)生接枝反應后，在一定時間內其產物溶解性隨時間增加逐漸變大。可能原因是在反應初期，由于綠豆蛋白分子引入了糖鏈，為其增加了親水性羥基，增加了蛋白質分子的親水性，而且加熱處理有助于蛋白質溶解度的提高，隨著反應的進行，親水性羥基增加的效果不顯著，在反應后期，溶解度增加平緩，可能是隨著反應時間的延長，造成部分蛋白分子的熱聚集，使其溶解度增加變緩。葡萄糖糖基化產物的溶解性要高于麥芽糖糖基化產物。蛋白質具有特定的空間結構，接上糖鏈之后，空間結構被破壞，使蛋白質分子極性增強，其次多羥基的親水特性也可使得整個分子的溶解性明顯提高[21]。但由于糖鏈長度不同，產生了不同的空間位阻效應，糖鏈越長，效應越明顯，進而阻止糖蛋白的空間展開，使蛋白質分子發(fā)生聚集，致使溶解度降低，出現葡萄糖優(yōu)于麥芽糖的現象。

圖4 接枝產物溶解度的變化Fig.4 Changes on the solubility of the graft products

2.4 糖基化反應對乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

將綠豆分離蛋白分別與葡萄糖和麥芽糖在水浴條件下進行反應，不同反應時間反應產物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別如圖5和圖6所示。隨著糖基化反應時間的延長，乳化活性和乳化穩(wěn)定性得到改善，均顯著提高（p＜0.05），且整體上麥芽糖要高于葡萄糖。劉燕等研究也表明糖基化后的大豆蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性有不同程度的提高[22]。對乳化活性而言，麥芽糖要強于葡萄糖，當反應到一定程度后，乳化活性達到最高，但出現糖基化產物乳化活性增加的幅度不斷減小，甚至出現下降的現象。前人在研究大豆分離蛋白和半乳甘露聚糖的糖基化反應產物的乳化性時[23]，同樣出現隨著反應時間的增加，復合物的乳化活性將經歷上升和下降兩個過程，開始糖與蛋白質發(fā)生共價交聯，由于糖的親水性使產物的表面活性增加，從而乳化性得到提高，但當反應達到一定程度后，其交聯程度越來越高，使產物過于親水而失去界面活性，從而降低了產物的乳化性。對于乳化穩(wěn)定性而言，隨著反應時間的延長，分子間空間位阻增大，更加有效地阻止了油滴的聚集和乳化狀態(tài)的破壞，從而提高了蛋白分子的乳化穩(wěn)定性，相同反應時間下，麥芽糖與綠豆分離蛋白的糖基化產物的乳化穩(wěn)定性比葡萄糖好，說明麥芽糖比葡萄糖更有利于改善綠豆分離蛋白質的乳化穩(wěn)定性。

圖5 接枝產物乳化活性的變化Fig.5 Changes on the emulsifying activity of graft products

圖6 接枝產物乳化穩(wěn)定性的變化Fig.6 Changes on the emulsion stability of graft products

2.5 糖基化反應對起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

蛋白質能作為起泡劑主要取決于蛋白質的表面活性和成膜性，水溶性蛋白質可被起泡吸附以降低表面張力，使蛋白質逐漸凝固在氣液界面間形成有一定剛性和彈性的薄膜[24]。將綠豆分離蛋白分別與葡萄糖和麥芽糖在水浴條件下進行反應，不同反應時間反應產物的起泡性和起泡穩(wěn)定性分別如圖7和圖8所示。隨著時間的增長，糖基化蛋白的起泡性和蛋白質的起泡性和起泡穩(wěn)定性都得到了改善，均顯著提高（p＜0.05），起泡性呈現先增加后減小的趨勢，起泡穩(wěn)定性穩(wěn)步升高，且葡萄糖要高于麥芽糖。魯倩等研究也表明糖基化修飾可有效提高起泡性[25]。加熱時間延長，起泡能力先升高再降低，這是可能因為當糖鏈接入到蛋白分子上，其親水基團會增加蛋白的水溶性，增加起泡能力，隨后所發(fā)生的起泡力下降的可能原因是交聯后的蛋白質分子量會明顯增大，蛋白質分子的空間位阻以及糖鏈所引起的強烈電荷效應導致接枝物的起泡力隨時間的延長呈下降趨勢。起泡穩(wěn)定性的穩(wěn)定升高，可能由于分子引入了羥基，使得分子間的靜電作用增強，分子間的靜電吸引力增加了在空氣與水界面上蛋白質膜的厚度和硬度，從而使的接枝物的泡沫穩(wěn)定性增強。相比較而言，葡萄糖效果要明顯，這可能由于分子量和粘度的不同決定了它們起泡性能間的差異。

圖7 接枝產物起泡性的變化Fig.7 Changes on the foaming capability of graft products

圖8 接枝產物泡沫穩(wěn)定性的變化Fig.8 Changes on the foam stability of graft products

3 結論

采用堿溶酸沉法提取綠豆分離蛋白，通過水浴加熱制得糖基化產物，并對其功能特性進行了測定。經測定四種糖基化產物的接枝度隨時間的延長逐漸上升，葡萄糖的接枝程度大于麥芽糖，紅外光譜也驗證了蛋白質和糖共價結合成了聚糖分子，且二級結構都產生了變化，α-螺旋結構含量有所升高，β-折疊結構含量有所降低，β-轉角結構含量小幅升高，無規(guī)卷曲結構含量小幅降低，溶解度呈現上升的趨勢，葡萄糖糖基化產物的溶解性要高于麥芽糖糖基化產物，乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸得到提高，且麥芽糖改善效果較好，起泡性和起泡穩(wěn)定性都得到了改善，葡萄糖效果較明顯，為充分利用綠豆蛋白這一植物蛋白提供了基本的理論和方法。

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Effect of glycosylated processing on functional properties of mung bean protein isolate

WANG Xiao，JIANG Lian-zhou*，LI Yang，WANG Zhong-jiang，LIANG Jing，CHEN Yong
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to explore functional properties of mung bean protein isolate by glycosylated processing ，the degree of grafting，infrared spectroscopy，as well as solubility，emulsification and emulsion stability，foaming and foaming stability were investigated.The results demonstrated that compared to maltose ，the grafting degree of the resulting reaction product by using glucose was higher than the maltose，and it was easier to react.Infrared spectroscopy showed sugar and protein covalent complexes were generated.The content of α -helix and β-turn structure increased，while the other two structures decreased.The solubility of mung bean protein isolate after glycosylation was improved，and the result with glucose was better than that with maltose.The emulsifying activity and emulsion stability of mung bean protein isolate after glycosylation were improved，and the reaction with maltose had better results.The foaming and foam stability of mung bean protein isolate after glycosylation were improved，and the effect of glucose was more pronounced.

glycosylation；mungbeanproteinisolate；degreeofgrafting；infraredspectroscopy；functionalproperties

TS214.9

A

1002-0306（2014）20-0097-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.012

2014－04-08

王曉（1989-），男，碩士研究生，研究方向：食品工程。

* 通訊作者：江連洲（1960-），男，博士，教授，研究方向：糧食，油脂及植物蛋白工程。

國家自然科學青年科學基金項目（31301501）。