面包蝦中副溶血性弧菌在pH影響下生長預測模型的建立

賀 群，黃 和，*，劉 亞，蔣志紅，勵建榮

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.渤海大學，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州 121013）

面包蝦中副溶血性弧菌在pH影響下生長預測模型的建立

賀 群1，黃 和1，*，劉 亞1，蔣志紅1，勵建榮2

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.渤海大學，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州 121013）

為探討pH對面包蝦生產過程中副溶血性弧菌的生長規律的影響，測定了不同pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）下副溶血性弧菌的生長曲線，運用Origin 8.0軟件和DMFit軟件，分別采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型對生長曲線進行擬合，選擇決定系數最高的方程建立初級模型，并求出最大比生長速率。應用修正Arrhenius模型擬合最大比生長速率和pH之間的曲線建立二級模型。結果表明，通過模型檢驗比較，修正Compertz模型的擬合度較好（決定系數=0.99），進一步擬合所得二級模型擬合度較好（決定系數=0.98），偏差因子為0.99，準確因子1.0，均在可接受的范圍內，表明模型能較好的預測面包蝦中副溶血性弧菌在pH為5.5～8.5環境下的生長動態。

面包蝦，副溶血性弧菌，生長模型

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，具有嗜鹽性，最適生長pH是7～8，對酸敏感[1]。副溶血性弧菌主要中毒食品是海產品和鹽腌制品，感染臨床癥狀主要是腹瀉、胃寒發熱、惡心、嘔吐等典型胃腸炎癥狀。來自國家食源性疾病監測網的數據顯示，自1998年以來，副溶血性弧菌引起的中毒事件已經高居我國微生物中毒的首位[2]。姬華[3]、吳英嬌[4]、田金玲[5]、盧曉鳳等[6]研究了對蝦、蛤肉和模擬蟹肉中副溶血性弧菌在不同培養條件下的變化規律，發現Gompertz方程擬合度較高。Zwietering等[7]經過比較發現修正Gompertz方程更能充分描述細菌生長曲線。Miles[8]、Gooch[9]、Soon等[10]研究了不同培養條件下致病性和非致病性副溶血性弧菌在肉湯和牡蠣中的生長情況，發現初級模型都能較好的符合修正Gompertz方程。

副溶血性弧菌的感染大部分是因為食用了未熟透或者在生產加工流通過程中再次污染的海產品所導致的，尤其是蝦[11]。我國的對蝦產品生產量居世界首位，也在世界蝦產品交易中占較大份額，在過去，我國對蝦產品的出口主要是以冷凍蝦為主，但進入21世紀后，蝦制品出口量有了較大幅度增長，并很快占據了主要地位[12]。在2005年初美國對我國初級冷凍蝦類產品開始征收高額反傾銷稅后，我國冷凍蝦出口嚴重受阻，也直接導致了我國蝦類產品出口的降低，面包蝦作為一種鮮蝦的深加工產品，占到了我國蝦類產品出口增長的一大半，帶動了我國整個蝦類產品的出口。面包蝦在生產過程中除去低溫幾乎沒有任何的抑菌工序，因此，本文通過研究不同pH影響下的面包蝦中副溶血性弧菌的生長動態，確定最適初級模型，建立生長動力學參數最大比生長速率和遲滯期與溫度之間的二級模型，探討面包蝦中副溶血性弧菌生長規律與pH環境之間的關系，對完善面包蝦的加工技術具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝴蝶形面包蝦 湛江國聯水產股份有限公司提供；副溶血性弧菌（ATCC17802） 廣東省微生物研究所，菌株在含3%NaCl和20%甘油的腦心浸液肉湯（BHI）中于-80℃保存，菌株接種于2.5%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）中，37℃培養箱中培養16～20h，活化3代備用；腦心浸液肉湯（BHI）、TCBS瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（2.5%NaCl TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、營養瓊脂（NA） 均購自青島海博生物技術有限公司；NaCl、Na2HPO4·2H2O 、NaH2PO4·2H2O 分 析 純 ，廣 東 省 光華科技股份有限公司。

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；拍擊式均質器 西班牙IUL公司；SPX-250B-Z型生化培養箱（5～50℃，± 1.5℃） 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Sartorius PB-10型pH計 德國賽多利斯公司；電子天平 日本島津公司；1mL、200μL移液槍 德國Eppendorf公司；BCD-277型冰箱 博西華家用電器有限公司。

1.2 菌懸液的制備

將副溶血性弧菌劃線接種于TCBS平板，挑取典型綠色斗笠狀菌落，接種至含有9mL 2.5%NaCl TSB的試管中，37℃、120r/min培養12h，利用無菌的2.5% NaCl TSB培養基的調節菌液OD600為0.5[3]，用無菌3% NaCl堿性蛋白胨水梯度稀釋，選擇10-4稀釋度作為添加的菌懸液。

1.3 實驗用無菌面包蝦的制備[3，13]

將面包蝦分裝于高壓平口袋中，約40g/包，真空包裝，面包蝦在400MPa、28℃下處理20min。超高壓處理后準確稱取10g面包蝦于無菌均質袋中，加入90mL無菌3%氯化鈉堿性蛋白胨水，均質機拍打90s，吸取100μL面包蝦勻漿液，采用傾注平板法倒3%NaCl NA和2.5%NaCl TSA平板，37℃培養48h，不長菌代表超高壓處理殺死了所有的雜菌。將無菌的面包蝦置于-18℃冰箱中備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 副溶血性弧菌的接種、培養及計數[3]無菌稱取10g無菌面包蝦置于直徑為90mm無菌培養皿中，用 不同pH的磷 酸緩 沖 液 浸 泡1～2h后 撈 出 瀝 干[5]，每份蝦仁用無菌槍頭均勻注射接種100μL菌懸液，接種后使面包蝦的初始菌數達到102～103CFU/g。

接種完畢后，置于30℃生化培養箱中培養，在選定的時間取出樣品于無菌均質袋中，加入90mL無菌3%氯化鈉堿性蛋白胨水，均質機拍打90s，吸取1mL面包蝦勻漿液注入含有9mL無菌3%氯化鈉堿性蛋白胨水試管中，渦旋混勻后進行逐級稀釋，選擇3個連續的適宜稀釋度，吸取100μL采用傾注法倒2.5% NaCl TSA平板，37℃培養24h后計數[3，14]。

1.4.2 生 長 模 型 的 建 立 一 級 模 型 的 擬 合 采 用Origin 8.0 軟 件（美 國 Microcal公 司）和 DMFit軟 件（http：//modelling.combase.cc/DMFit.aspx），分別用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型[15-17]擬合面包蝦在不同溫度下實際測得的副溶血性弧菌濃度隨時間變化的生長曲線，再做對比選出最適模型，3種模型的方程分別為：

式（1）、式（2）中，logNt是在時間t時菌落計數的對數值（lgcfu/mL），A是初始菌量，C是初始菌量和最大菌量之間的差值（lgcfu/mL），M是生長速率達到最大值時的時間，B是在時間M時的相對最大生長速率（h-1）。式（3）中，y0和ymax分別是細菌的初始菌量和最大菌量；μm是最大比生長速率[lg（cfu/mL）/h-1]；tlag即遲滯期（h）。修正Gompertz模型、修正Logistic模型生長參數參照姬華[3]來計算。

Davey[18]將 自 然 對 數 方 程 與Arrhenius關 系 式 聯用，用來描述微生物生長速率與環境因子之間的關系，其方程為：

式（4）中，k是生長速率，即GR，是回歸系數，根據初級最適模型求得GR，將GR和對應的pH代入方程式，擬合出，然后代入原方程，求得二級模型。二級模型采用Origin 8.0軟件擬合。

1.4.3 模型的數學檢驗 一級模型的擬合優度采用決定系數R2評價。二級模型的殘差平方和（RSS）、平方根誤差（RMSE）、偏差因子（Bf）和準確性因子（Af）來評定[16]，表達式如下：

式中，μobs和μpred分別最大比生長速率的觀測值和預測值，n為實驗次數。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌一級生長模型的建立

修正Gompertz模型、修正Logistic模型對副溶血性弧菌在pH為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5的生長曲線進行擬合，由Origin 8.0軟件計算出擬合方程的各個參數，如表1所示。

表1 修正Gompertz模型、修正Logistic模型參數及統計分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz model and modified Logistic model

使用Baranyi模型對副溶血性弧菌在pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的生長曲線進行擬合，DMFit軟件同時還計算出了模型的生長速率μm以及擬合曲線的標準差s和決定系數R2，所得的參數及統計分析如表2所示。

表2 Baranyi模型參數及統計分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

實驗結果表明，修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型擬合，均能得到較高的決定系數，分別為0.99、0.98、0.99，選用修正Gompertz模型得出的 參 數 進 一 步 建 立 二 級 模 型 ，以lg（Nt/N0）對 時 間t作圖，副溶血性弧菌的一級模型擬合曲線如圖1所示。pH為5.5～8.5之間修正Gompertz模型的最大比生長速 率 μm[（lg（cfu/mL）h）分 別 為 0.5164、0.5244、0.5363、0.5510、0.5728、0.6008、0.6182，隨著pH的升高，微生物的最大比生長速率也隨之升高。

2.2 副溶血性弧菌二級生長模型的建立

將不同pH下修正Gompertz模型擬合得到的最大生長速率GR代入式（4）擬合，即得到最大生長速率-pH的二級模型，擬合曲線見圖2。

得 到 的 擬 合 方 程 為 ：lnGR=-0.053-0.081×pH+ 0.010×（pH）2式（9）

從圖2中可以看出，pH5.5～8.5范圍內，副溶血性弧菌的比生長速率隨著pH的升高而增加，擬合方程的決定系數R2達到了0.98。

比生長速率的預測值與實測值的殘差平方和（RSS）、平 方 根 誤 差（RMSE）、偏 差 因 子（Bf）、準 確 性因子（Af）見表3。

表3 比生長速率的預測值與實測值的統計學分析Table 3 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

從實驗結果可以看出，二級模型具有較高的R2和較低的RSS值，表明Ratkowsky平方根模型對生長速率的擬合度較好，通過數學參數檢驗，比較μm的預測值與實測值，可以計算出偏差因子和準確因子，從上表可以看出，RMSE值較小，預測值和實測值的偏差很小，偏差因子Bf接近于1；準確因子Af也接近于1，表明模型的擬合效果好，準確度高，能很好地預測面包蝦中副溶血性弧菌的生長。

3 結論與討論

本實驗研究了面包蝦中副溶血性弧菌在不同pH（5.5～8.5）影響下的生長動態，選擇擬合度最好的修正Gompertz方程（R2=0.99）來建立初級模型，求得副溶血性弧菌的生長動力學參數最大比生長速率。采用自然對數方程與Arrhenius聯用方程來擬合最大比生長速率與環境因子pH之間的規律，擬合度高（R2= 0.99）。經過數學驗證，模型具有較低的RSS值和RMSE值，偏差因子和準確因子分別為0.99和1.0，均在可接受的范圍內，表明模型能較好的描述不同pH影響下面包蝦中副溶血性弧菌的生長規律。

王璐華[19]采用濁度法建立了3%氯化鈉堿性蛋白水中中副溶血性弧菌在不同pH影響下的預測模型，結果表明pH在5.5～10.0之間時，副溶血性弧菌的最大比生長速率是隨著pH的升高而先增大后減小，在pH為8.5時達到最大。李濤[20]研究了TSB中副溶血性弧菌在不同pH影響下的生長情況，在pH為8時達到最大。這些都與本文結果類似，但考慮到在調整pH的方法和所選擇的培養基上存在的區別以及菌株之間本身存在的特性差異，在具體的生長動力學參數上可能存在差距。

面包蝦作為一種鮮蝦的深加工產品，其也占據了蝦制品出口中一定的份額。然而在實際的生產過程中，除了依靠低溫抑制微生物的生長，通過調整pH、鹽度等能影響微生物生長的因素的方法也是完善面包蝦加工技術的又一途徑。副溶血性弧菌作為一種重要的食源性致病菌，在蝦體本身尤其是夏季更是檢出率頗高，因此，在面包蝦的加工環節，通過有效的手段降低其繁殖速率和數量，也是保證面包蝦安全生產的必要措施。

圖1 pH為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5條件下面包蝦中副溶血性弧菌的一級生長模型Fig.1 The primary growth model for Vibrio parahaemolyticus in Bread Shrimp at 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 of pH

圖2 lnGR和pH二級模型擬合曲線圖Fig.2 Fitted curve of growth rate and pH of the secondary model

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Establishment of growth predictive model of Vibrio parahaemolyticus in bread shrimp under different pH condition

HE Qun1，HUANG He1，*，LIU Ya1，JIANG Zhi-hong1，LI Jian-rong2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Food Safety Key laboratory of Liaoning Province，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

To study the impact of pH to the growth law of Vibrio parahaemolyticus in the process of bread shimp，growth curves under different pH （ 5.5 ， 6.0 ， 6.5 ， 7.0 ， 7.5 ， 8.0 and 8.5 ， respectively ） were determined.The modified Compertz，modified Logistic and Baranyi models，respectively，were applied to fit the growth curves by Origin 8.0 software and DMFit software，the maximum specific growth rates was calculated by the primary model with the highest coefficient of determination.The modified Arrhenius model was used to fit the curves between the maximum specific growth rates and pH for the establishment of the secongary model.Results showed that the modified Compertz model（R2=0.99） was more accurate and useful in fitting V.parahaemolyticus growth curves than the modified Logistic and Baranyi&Robert models，respectively.And the secondary model had a high goodness-of-fit（R2=0.98 ）.The values of bias factor and accuracy factor were also acceptable statistically that were close to 1.0.The predictive models were highly reliable.These could effectively predict the growth of Vibrio parahaemolyticus under above pH condition.

bread shrimp；Vibrio parahaemolyticus；growth model

TS201.3

A

1002-0306（2014）20-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.014

2014-03-17

賀群（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。

* 通訊作者：黃和（1962-），男，教授，研究方向：食品質量與安全。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；廣東省省部產學研結合項目（2011B090400154）；湛江市科技計劃項目（湛科[2010]174號）。