維生素E微膠囊復水后乳狀液的穩定性研究

楊 雷，仇 丹，，*，周逸奎，李志鵬，湯成科，阮小琳，張麗芳，章文虎

（1.寧波工程學院化工學院，浙江寧波 315016；2.浙江新維普添加劑有限公司，浙江新昌 312500）

維生素E微膠囊復水后乳狀液的穩定性研究

楊 雷1，仇 丹1，2，*，周逸奎2，李志鵬1，湯成科1，阮小琳1，張麗芳2，章文虎2

（1.寧波工程學院化工學院，浙江寧波 315016；2.浙江新維普添加劑有限公司，浙江新昌 312500）

通過高效液相色譜精確計算乳狀液載油率，并以載油率定量評價乳狀液的穩定性；考察環境因素對乳狀液穩定性的影響，發現乳狀液最適pH為7，溫度、離子濃度和游離OS濃度的增加均不利于乳狀液穩定；利用響應面法擬合四個環境因素對VE復水后乳狀液穩定性的作用，結果表明四個因素對載油率的貢獻率依次為：溫度＞NaCl濃度＞游離OS濃度＞pH。

維生素E，乳狀液，穩定性，載油率

維生素E（又名生育酚）是一種具有抗氧化、抗不育、增強機體免疫力等多種生理功能的脂溶性維生素[1-2]。但由于其化學穩定性不好，商業化維生素E產品絕大部分是維生素E乙酸酯（VE）。市場上應用的VE產品多為VE微膠囊，它有利于VE的保存、運輸和使用，在成本及應用上都非常有優勢[3]。在飲料、乳品等實際生產過程中，VE微膠囊需要在各種復雜體系中快速復水成為乳狀液，這時乳狀液穩定存在且不產生浮油就成為評判VE微膠囊產品品質的關鍵指標[4]。

對于乳化包埋良好的VE微膠囊，體系的環境因素會直接影響復水后乳狀液的穩定性，但這些因素對乳狀液的影響規律尚未被系統研究。一般認為乳化劑類型、均質條件、溫度、pH、離子濃度、乳化劑使用量以及儲存條件等均對乳狀液的穩定性有一定的影 響[5-9]，對 于 辛 烯 基 琥 珀 酸 淀 粉 酯（OS 淀 粉）穩 定的VE乳狀液，我們特別指出OS淀粉的游離OS含量也會顯著影響VE乳狀液的穩定性[10]。此外，目前常用于評價乳狀液穩定性的方法主要有分相體積測量法、Turbiscan 分 析 儀 法 、激 光 粒 度 分 析 儀 法 等[11-12]，但是這些方法很難精確區分乳化穩定性差異較小的乳狀液。

針對以上問題，本文以OS淀粉包埋的商業化VE微膠囊為研究對象，模擬實際應用過程，先建立了利用高效液相色譜（HPLC）計算載油率并評價乳狀液穩定性的方法，接著比較pH、溫度、離子濃度及游離OS濃度等環境因素對VE微膠囊復水后乳狀液載油率的影響，最后運用響應面法擬合得到數學模型，比較四個環境因素對載油率的貢獻率。本研究緊密結合食品生產實際，以期所建立的分析方法和環境因素的影響規律可直接指導生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VE微膠囊 標示含量50%，實際含量50.80%，浙江新維普添加劑有限公司；VE（維生素E乙酸酯） 標示含量50%，實際含量50.80%，浙江新維普添加劑有限公司；α-淀粉酶 山東棗莊市杰諾生物酶有限公司；辛烯基琥珀酸酐（OSA） 上海安耐吉化學公司；乙醇、甲醇、NaCl、CaCl2、NaOH、HCl等試劑。

JRJ300-1高速剪切混合乳化機 上海標本模型廠；P680戴安高效液相色譜儀 美國戴安公司；LD5-2A臺式低速離心機 北京京立離心機有限公司；Malvern 2000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；RH basic 2磁力攪拌機 德國IKA集團；Turbiscan Lab分析儀 法國Formulaction公司。

1.2 維生素E微膠囊復水乳狀液的制備

將一定量VE微膠囊加入250mL去離子水中，混合均勻后用JRJ300-1高速剪切混合乳化機剪切乳化，得到乳狀液。

實驗選取了三種復水工藝，分別是工藝1（VE微膠囊投料量10g，剪切時間5min，剪切轉速1000r/min）、工藝2（VE微膠囊投料量20g，剪切時間10min，剪切轉速2000r/min）和工藝3（VE微膠囊投料量30g，剪切時間15min，剪切轉速3000r/min）。

1.3 乳狀液的穩定性測定方法篩選

1.3.1 分相體積法 取10mL乳狀液在440g下離心5min，比較離心后的油水比（油相體積與水相體積的比）以評價乳狀液的穩定性[11]，比值越小說明乳狀液越穩定。

1.3.2 Turbiscan分析儀法 檢測乳狀液置于Turbiscan分析儀中，溫度控制40℃，分析獲得2h內乳狀液的穩定因子，乳狀液穩定性隨穩定因子的減小而增加。

1.3.3 激光粒度分析儀法 將乳狀液置于分散設備中，利用水作為分散劑（折射率1.330），控制轉速1000r/min，設定折射率為1.358，顆粒吸收度為0.001，測得乳狀液的粒徑大小，一般認為粒徑越小越穩定。

1.3.4 HPLC法 盡管陸續有文獻[13-14]報道過VE微膠囊包埋率的HPLC測定方法，但這些依靠溶劑提取的方法無法直接應用于乳狀液穩定性的測定。根據之前的報道[10]，我們改進了HPLC方法。色譜柱為Phenomenex Kinetex C18柱（2.6μm，100mm ×4.6mm）；流動相為甲醇；檢測波長285nm；流速1mL/min；檢測溫度為30℃；進樣量20μL。

利用HPLC測定乳狀液進樣的VE含量，對比乳狀液內部VE含量，進一步獲得VE載油率從而定量地反映出乳狀液的穩定性；在總質量為W（g）的乳狀液中（加入VE微膠囊W0），取內層乳狀液樣品0.5000g（W1），加入1mL α-淀粉酶，在38℃水浴中恒溫酶解10min，然后用乙醇定容至10mL，混勻后以4000r/min離心5min，再取1mL上清液并用甲醇定容至10mL，過濾后進行HPLC進樣分析，進樣的VE含量（W2）通過將峰面積代入VE的標準曲線求得。載油率按以下公式計算：

式中，5000為稀釋倍數，50.80%為微膠囊中VE的實際含量。

1.4 VE標準曲線的制作

稱取1.0000g VE于50mL乙醇中，移取10mL至50mL容量瓶中作為母液，用甲醇定容，再各自移取0.1、1、2、5、10、25mL于50mL容量瓶中定容，通過HPLC分析得到標準曲線。

1.5 單因素實驗設計

為了研究pH對乳狀液的影響，將去離子水的pH預先調到3、4、5、6、7、8，其他條件不變，再用于VE微膠囊復水；在探究溫度對乳狀液的影響時，僅改變乳狀液復水后的儲存溫度，分別控制溫度為30、35、40、45、50℃；加入不同質量的NaCl、CaCl2使去離子水的離子濃度分別達到0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7N，再在相同條件下復水來比較離子濃度對乳狀液的作用；為比較游離OS濃度對乳狀液的影響，將一定量的辛烯基琥珀酸酐（OSA）溶于去離子水中，磁力攪拌過夜，水解完全后調節pH為7，使去離子水的游離OS濃度分別達到0、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L，再用于復水制備乳狀液，控制其他條件不變。

1.6 響應面實驗設計

根 據 pH（X1）、溫 度（X2）、NaCl濃 度（X3）、連 續 相游離OS濃度（X4）4個單因素實驗確定的水平范圍，利用Box-Behnken響應面優化設計實驗[15]，以載油率為響應值，做4因素3水平響應面的分析實驗。因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.7 數據處理

實驗所得數據均為3次實驗的平均值，使用SAS 9.2 進行杜凱氏差距檢定的方差分析法分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線實驗結果

經Origin軟件擬合，得到標準曲線為Y（mAU·min）=2.90882X（μg）+0.53687，其中Y代表VE的峰面積，X代表VE的進樣量，線性相關系數R2=0.99988，說明該曲線準確性高，能夠應用于VE含量的測定，曲線適用濃度范圍為0.16～40μg。

2.2 穩定性測試方法對比

表2為不同復水工藝條件下不同穩定性測試方法所得數據。由表2可知，由復水工藝2制得的乳狀液具有最小的穩定因子（0.30）和平均粒徑（0.479μm），同時載油率最大（99.34%），顯然該乳狀液最穩定。由于乳狀液的載油率隨著穩定性的增加而增大，說明利用載油率來評價乳狀液穩定性是可行的；另外，表2中的3個乳狀液均無法測出油水比，說明分相體積法評價穩定性較差的乳狀液較為實用，對于基本完全乳化的乳狀液則無法判斷穩定性的差異；通過檢測粒徑和穩定因子能夠比較乳狀液的穩定性，但無法判斷乳狀液是否已完全乳化，而由HPLC測得的載油率能直觀地體現乳狀液的乳化程度，載油率越大意味著乳化越完全。綜上，由HPLC等常規設備測定的乳狀液的載油率，可以快速準確地評價乳狀液的穩定性，本文將以載油率為評價指標研究各因素對乳狀液穩定性的影響。

圖1 VE的標準曲線Fig.1 Standard curve of vitamin E

表2 不同復水工藝所得乳狀液的穩定性Table 2 The stability of different emulsion after redissolving microcapsule

2.3 單因素對乳狀液穩定性影響

實驗所選取的復水工藝均具有較好的穩定性，而工藝2相較于另兩種工藝具有最好的穩定性，因此下文均選取復水工藝2進行進一步的單因素實驗。

2.3.1 pH對乳狀液穩定性影響 由圖2可知，pH為7時乳狀液的載油率有最大值99.34%，接近100%，酸性和堿性條件下乳狀液穩定性較pH=7時略有下降。由于OS淀粉在堿性條件下易發生水解，所以載油率降低；當pH呈酸性時，盡管對OS淀粉影響較小，但對VE有一定影響，導致載油率也不高。pH的考察范圍定為6～8。

2.3.2 溫度對乳狀液穩定性影響 圖3為將復水后乳狀液置于20～60℃下載油率的變化情況，在其他因素不變的條件下，溫度越高乳狀液的穩定性越差。這可能是因為在較高的溫度下，VE乳狀液中分子的平均動能增加，由于布朗運動的存在導致界面膜的破壞，使乳狀液的穩定性降低。由曲線的下降趨勢可以確定溫度的考察范圍為30～50℃。

圖2 pH對乳狀液穩定性影響Fig.2 The effect of pH value on emulsion’s stability

圖3 溫度對乳狀液穩定性影響Fig.3 The effect of temperature on emulsion’s stability

2.3.3 離子濃度對乳狀液穩定性影響 圖4表明，當乳狀液連續相的NaCl和CaCl2濃度在0～0.7N之間時，載油率的變化曲線類似，乳狀液的穩定性都隨著離子濃度的升高而降低，當離子濃度大于0.3N后，下降趨勢趨緩。在乳狀液形成過程中，離子會改變乳狀液的粒徑大小，同時可以改變乳化劑在界面膜上的吸附能力，導致乳狀液穩定性降低。綜合考慮離子濃度的考察范圍選取NaCl濃度為0.3～0.7N。

圖4 離子濃度對乳狀液穩定性影響Fig.4 The effect of ion concentration on emulsion’s stability

2.3.4 游離OS對乳狀液穩定性影響 VE微膠囊由OS淀粉乳化VE所得，一般OS淀粉的OS含量都小于3%，在本文的乳狀液體系中（20g VE微膠囊+250mL水），理論上連續相中OS濃度最大值約為1.2g/L。圖5中額外添加了游離OS使去離子水中OS的濃度達到0.20～0.60g/L（相當于OS淀粉質量的0.5%～1.5%），結果發現乳狀液的穩定性隨著游離OS濃度的增加而下降。游離OS在乳狀液乳化的過程中由于OS本身所具有的兩親性會阻礙乳狀液形成界面膜，甚至在乳狀液形成后改變其界面機械強度，進一步影響乳狀液的穩定性。從曲線的下降趨勢考慮，連續相中游離OS濃度的考察范圍定為0.20～0.60g/L。

表3 Box-Behnken設計方案及響應值結果Table 3 The design and the response value of Box-Behnken

圖5 連續相的游離OS濃度對乳狀液穩定性影響Fig.5 The effect of free-OS concentration of continuous on emulsion’s stability

2.4 實驗條件的優化

在完成其單因素實驗后，文章選取四個因素進行響應面實驗，實驗結果如表3所示。

通過統計分析軟件SAS9.2對數據進行多元回歸擬 合 ，對 載 油 率 與 pH（X1）、溫 度（X2）、NaCl濃 度（X3）和游離OS濃度（X4）之間建立二次響應面回歸模型如下：

從表4的結果可以看出，所得的Y回歸模型達到極其顯著水平（p=0.0003＜0.001），失擬檢驗不顯著（p=0.0756＞0.05），說明此回歸模型較理想，用方程Y擬合4個因素與載油率之間的關系是可行的。模型的R2=0.9091，說明該模型擬合度較好。綜合以上分析可得，該模型與實際情況擬合較好，可用于預測載油率的變化情況。由F檢驗可得出因子貢獻率為：X2＞X3＞X4＞X1，即溫度＞NaCl濃度＞游離OS濃度＞pH。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 4 Significance test of regression eguation module

3 結論

評價乳狀液穩定性的方法有很多，但在實際的檢測過程中都無法精確區分乳狀液穩定性的差異，為此，本文通過建立高效液相色譜法來檢測乳狀液的載油率，同時通過載油率定量地評價乳狀液的穩定性。通過對不同復水工藝所得VE乳狀液進行分析，對比分相體積法、Turbiscan分析儀法和激光粒度分析儀法等方法，確定用載油率可有效評價乳狀液的穩定性。

通過單因素實驗考查了pH、溫度、離子濃度和游離OS濃度對乳狀液載油率的影響，發現最適pH為7，溫度、離子濃度和游離OS濃度的增加均導致乳狀液載油率的下降。在單因素的基礎上進行響應面法分析，建立了VE微膠囊復水后乳狀液載油率的數學模型，所得的Y回歸模型較為理想，可以進行實際預測。各因素對載油率的貢獻率為：溫度＞NaCl濃度＞游離OS濃度＞pH。

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Study on the stability of Vitamin E emulsion after redissolving of microcapsule

YANG Lei1，QIU Dan1，2，*，ZHOU Yi-kui2，LI Zhi-peng1，TANG Cheng-ke1，RUAN Xiao-lin1，ZHANG Li-fang2，ZHANG Wen-hu2
（1.College of Chemical Engineering，Ningbo University of Technology，Ningbo 315016，China；2.Zhejiang NVB Co.，Ltd.，Xinchang 312500，China）

A high-performance liquid （HPLC ） chromatography method was established to analyze the oil load efficiency of VEemulsion，and the obtained data could be used to evaluate the stability of emulsion.The effect of pH，temperature，ion concentration and free-OS concentration on oil load efficiency of VEemulsion were examined.The results showed that the optimal pH was 7，and the stability of emulsions decreased along with the increasing temperature，ion concentration and free-OS concentration.Response surface methodology was further applied to study the formation of VEemulsion.And the relative degree of influence of all environmental factors on its oil load efficiency was that temperature＞NaCl concentration＞free-OS concentration＞pH.

Vitamin E；emulsion；stability；oil load efficiency

TS218

A

1002-0306（2014）20-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.024

2014－01－06

楊雷（1993-），男，大學本科在讀，研究方向：精細化工。

* 通訊作者：仇丹（1981-），男，博士，副教授，研究方向：生物醫藥化學。

浙江省青年自然科學基金（LQ12B06001）；寧波市自然科學基金（2013A610084）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201311058011）；浙江省大學生科技創新團隊資助項目；寧波市創新團隊（2011B82002）；王偉明助創基金（2014020）。