沙棘酒皮渣發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果的研究

焦 揚，李彩霞，高正睿，剛麗娟，張愛萍

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖 734000）

沙棘酒皮渣發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果的研究

焦 揚，李彩霞，高正睿，剛麗娟，張愛萍*

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖 734000）

采用地衣芽孢桿菌發(fā)酵沙棘酒皮渣，研究了發(fā)酵提取物（SBFE）對金黃色葡萄球菌的抑制效果。結(jié)果表明，SBFE對金黃色葡萄球菌的MIC為1.2mg/mL，且SBFE中抑菌成分具有較高的熱穩(wěn)定性，其最佳抑菌pH為7.5。在SBFE中加入大于2%的葡萄糖會降低抑菌效果，但加入大于0.5%的檸檬酸和小于8%的苯甲酸會增加抑菌效果。沙棘酒皮渣發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)可能是多種成分的共同作用，發(fā)酵可使多肽、多酚和黃酮等有效抑菌成分的濃度提高，增強了抑菌效果。

沙棘酒皮渣，發(fā)酵提取物，金黃色葡萄球菌，抑菌，穩(wěn)定性

沙棘是一種具有藥用和食用效能的植物，由于具有抗氧化、抗?jié)儭⒖鼓[瘤與抗炎等藥理功效[1]，使得沙棘資源受到了越來越廣泛的關(guān)注。前蘇聯(lián)科學(xué)家將沙棘由食用轉(zhuǎn)向醫(yī)用研究，并將沙棘果油和沙棘汁及其制品應(yīng)用于宇航食品[2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，不同品種、部位、產(chǎn)地及生長環(huán)境的沙棘資源，其成分與含量有所不同[3]。目前，對沙棘的利用多集中在果實和籽中生理活性物質(zhì)的提取和活性研究方面[4]，少有針對沙棘酒發(fā)酵副產(chǎn)物的發(fā)酵研究。

金黃色葡萄球菌是引起化膿性感染的重要病原菌，由于其在自然界中無處不在，食品受到其污染的機會很多。葡萄球菌引起的食品中毒已成為食品安全領(lǐng)域的重點課題，最突出的是金黃色葡萄球菌[5]。本工作將沙棘酒發(fā)酵后的皮渣用產(chǎn)蛋白酶的地衣芽孢桿菌發(fā)酵后對其有效物質(zhì)進(jìn)行粗提，研究發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果，旨在為功能性食品開發(fā)和天然防腐劑的應(yīng)用提供新的切入點，進(jìn)而為沙棘酒副產(chǎn)物的精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘酒皮渣 由甘肅張掖潤星生物科技有限公司提供，將沙棘酒分離得到的皮渣自然晾干，粉碎 過 60 目 篩 備 用 ；地 衣 芽 孢 桿 菌 30203（Bacillus licheniformis） 購于甘肅省微生物研究所；金黃色葡 萄 球 菌 （ Staphylococcus aureus）、 黑 曲 霉（Aspergillusniger）、灰 霉 菌（Botrytis cinerea）、酵 母 菌（Saccharomyces） 由河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院實驗室提供。

ZDX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TQHZ-2002A全溫振蕩搖床 太倉市華美生化儀器廠；AE200電子分析天平 Mettler Toledo公司；PHS-3C酸度計 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；722分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地衣芽孢桿菌種子液制備 將斜面保存的地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板上，培養(yǎng)24h后，將單菌落接入裝液量20mL/100mL的LB種子培養(yǎng)液中，于32℃，150r/min，振 蕩 培 養(yǎng) 14～16h，使 菌 濃 OD600達(dá) 到 1.2～1.5，得種子液。

1.2.2 沙棘酒皮渣發(fā)酵液和水提液制備 將種子液以5%接種量接入裝液量90mL/250mL、固液比1∶10的已滅菌沙棘酒皮渣液中，于34℃、150r/min，振蕩培養(yǎng)80h后，取樣采用2000r/min離心10min得沙棘酒皮渣發(fā)酵液。將皮渣以固液比1∶10混合后，將其滅菌后不接菌僅加入等量滅菌蒸餾水，于34℃、150r/min，振蕩培養(yǎng)80h后，取樣采用2000r/min離心10min，得沙棘酒皮渣水提液。

1.2.3 沙棘酒皮渣發(fā)酵提取物（SBFE）制備 將發(fā)酵液用濾紙除去固體不溶物后于65℃真空干燥至恒重，取適量用70%乙醇溶解[6]，得64mg/mL SBFE備用。

1.2.4 SBFE 抑 菌 穩(wěn) 定 性 的 方 法 將 SBFE 分 別 取0.2mL置于20、40、60、80、95℃水浴處理30min，以20℃處理為對照，考察溫度對SBFE抑菌穩(wěn)定性的影響；將SBFE用不同pH（5、6、7、8、9）的緩沖溶液稀釋，以pH6的SBFE為對照，考察pH對SBFE抑菌效果的影響及抑菌最適pH確定；在SBFE溶液中加入葡萄糖，以蒸餾水稀釋葡萄糖濃度為2%、4%、6%、8%、10%，以SBFE不加葡萄糖并做相應(yīng)稀釋為對照，考察葡萄糖濃度對SBFE抑菌效果的影響；在SBFE溶液中加入檸檬酸，然后用二倍法稀釋檸檬酸濃度為8%、4%、2%、1%、0.5%，以相應(yīng)稀釋的SBFE為對照，以檸檬酸溶液中不加SBFE為參比，考察檸檬酸對SBFE抑菌效果的影響；在SBFE溶液中加入苯甲酸，采用二倍法稀釋使苯甲酸濃度為8%、4%、2%、1%、0.5%，以相應(yīng)稀釋的SBFE為對照，以相應(yīng)苯甲酸濃度為參比，考察苯甲酸對SBFE抑制金黃色葡萄球菌的影響；將沙棘酒皮渣采用直接水提、發(fā)酵及對發(fā)酵液粗提（SBFE）后，考察處理方式對沙棘酒皮渣抑制金黃色葡萄球菌效果的影響。

1.3 抑菌方法

用直徑為9.0mm的打孔器于100mm直徑平板均勻打孔，每板3孔并適當(dāng)封閉孔底，加50μL樣品液于孔內(nèi)，無菌水為對照，取直徑為9.0mm黑曲霉、灰霉菌菌餅置于平板中央，于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

取200μL酵母菌或金黃色葡萄球菌菌液約107CFU/mL于100mm直徑平板上，用涂布棒均勻涂布，用直徑為9.0mm的打孔器均勻打孔，每板3孔并適當(dāng)封閉孔底，取50μL樣品液加于孔內(nèi)，無菌水或70%乙醇為對照，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48h。

以上采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.4 測定方法

1.4.1 多酚測定 采用Folin-Ciocalteu比色法測定。

1.4.2 多肽測定 以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽為標(biāo)準(zhǔn)物，參考文獻(xiàn)[7]。

1.4.3 總黃酮測定 以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)物，參考文獻(xiàn)[8]。

1.5 數(shù)據(jù)處理每個處理做3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差反映各指標(biāo)的大小，采用SSR法檢驗差異顯著性。Origin Lab 7.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酒皮渣發(fā)酵液的抑菌效果

取皮渣發(fā)酵考察其抑菌效果，結(jié)果如表1所示。

表1 沙棘酒皮渣發(fā)酵液的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of sea buckthorn wine residue fermented liquid

由表1可見，皮渣發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌有較強的抑制效果，但對酵母菌、黑曲霉、灰霉菌的抑制效果不明顯。由此主要探討發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

2.2 沙棘酒皮渣發(fā)酵提取物（SBFE）最小抑菌濃度（MIC）的確定由于皮渣發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，結(jié)合沙棘藥用和抗氧化研究[6，9]，以70%乙醇為空白，確定SBFE的MIC濃度，結(jié)果如表2所示。

表2 SBFE對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of SBFE on staphylococcus aureus

由表2可見，SBFE隨稀釋倍數(shù)增加其抑菌效果逐漸降低，通過二倍法和等步長稀釋后，確定SBFE的MIC濃度為1.2mg/mL。

2.3 SBFE的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 溫 度 對 SBFE 抑 菌 效 果 的 影 響 參 照 方 法1.2.4，考察溫度對SBFE抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見，SBFE經(jīng)不同溫度處理后，抑菌圈直徑與對照（20℃熱處理）沒有明顯差異，而且在80℃和95℃處理后抑菌圈直徑較對照略有增大，可能由于高溫使溶劑乙醇揮發(fā)，濃縮了抑菌成分而提高了抑菌效果。由此可得，SBFE中抑制金黃色葡萄球菌的成分具有較高的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 pH對SBFE抑菌效果的影響 參照方法1.2.4，考察pH對SBFE抑菌效果的影響及最適pH確定，結(jié)果如圖2所示。

圖1 溫度對SBFE抑菌效果的影響Fig.1 Effect of temperature on antibacterial effect of SBFE

圖2 pH對SBFE的抑菌效果影響（a）和最佳抑菌pH（b）確定Fig.2 Effect of pH on antibacterial effect of SBFE（a）and the best antibacterial pH（b）

由圖2（a）可見，隨著pH的升高，SBFE對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑先增大后減小。與對照相比，pH5時SBFE的抑菌效果降低，pH7～8之間的抑菌效果相對較好。進(jìn)一步縮小pH梯度后，由圖2（b）可見，SBFE在pH7.5時達(dá)到了最好的抑菌效果。由此可得，pH小于7和pH大于8的條件會降低SBFE對金黃色葡萄球菌的抑制效果，其最佳抑菌pH為7.5。

2.3.3 葡萄糖對SBFE抑菌效果的影響 參照方法1.2.4，考察葡萄糖對SBFE抑菌效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，SBFE中不加葡萄糖與加入葡萄糖后的抑菌趨勢是相反的，SBFE中不加葡萄糖的抑菌效果隨稀釋倍數(shù)的增大而減小。可見，一定量葡萄糖的加入降低了SBFE的抑菌效果。這可能是因為葡萄糖自身作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了金黃色葡萄球菌的生長進(jìn)而降低了SBFE的抑菌能力。由此，SBFE中存在大于2%的葡萄糖會降低其對金黃色葡萄球菌的抑制效果。

2.3.4 檸檬酸對SBFE抑菌效果的影響 參照方法1.2.4 ，考察檸檬酸對SBFE抑菌效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 葡萄糖對SBFE抑菌效果的影響Fig.3 Effect of glucose on antibacterial effect of SBFE

圖4 檸檬酸對SBFE抑菌效果的影響Fig.4 Effect of citric acid on antibacterial effect of SBFE

圖5 苯甲酸對SBFE抑菌效果的影響Fig.5 Effect of benzoic acid on antibacterial effect of SBFE

由圖4可見，檸檬酸溶液中不加SBFE時，其對金黃色葡萄球菌的抑制效果較顯著，隨檸檬酸濃度的降低抑菌效果也降低。而檸檬酸與SBFE復(fù)配后，抑菌效果較檸檬酸溶液中不加SBFE有明顯增加。與對照相比，檸檬酸溶液中加或不加SBFE其抑菌能力均顯著增加。可能的原因是一定濃度的檸檬酸溶液中解離的H+會影響金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜透性而增強其抑制作用。由此可見，在SBFE中加入濃度大于0.5%的檸檬酸均會顯著增強SBFE的抑菌效果。

2.3.5 苯甲酸對SBFE抑菌效果的影響 苯甲酸為食品中常用的防腐劑，易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，干擾細(xì)胞膜的通透性。參照方法1.2.4，考察苯甲酸對SBFE抑菌的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，在實驗濃度下，苯甲酸溶液中不加SBFE時，其對金黃色葡萄球菌的抑制效果很明顯，隨苯甲酸濃度降低抑菌效果為降低趨勢。在苯甲酸濃度小于8%后與SBFE復(fù)配，抑菌效果較單一苯甲酸溶液有增加趨勢。與對照相比，苯甲酸濃度小于8%后，單一苯甲酸溶液的抑菌效果均略減小，而苯甲酸中加入SBFE的抑菌能力有增加趨勢。由此可見，在SBFE中加入小于8%的苯甲酸會增加SBFE的抑菌效果。

2.4 處理方式對沙棘酒皮渣抑菌效果的影響

參照方法1.2.4，考察處理方式對沙棘酒皮渣抑菌效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 處理方式沙棘酒皮渣后的抑菌效果Fig.6 Antibacterial effect of different ways to deal with seabuckthorn wine residue on staphylococcus aureus

由圖6（a）可見，發(fā)酵液稀釋兩倍后抑菌效果有所增加，當(dāng)稀釋達(dá)到四倍時較原液的抑菌效果略有降低。由圖6（b）可見，沙棘酒皮渣的直接水提液原液與發(fā)酵液稀釋八倍后的抑菌效果相接近，但SBFE的抑菌效果較發(fā)酵液顯著增加。由此可得，對沙棘酒皮渣進(jìn)行發(fā)酵可顯著增加其抑菌效果，發(fā)酵液中的成分較復(fù)雜，其抑菌物質(zhì)可能為多種成分的協(xié)同作用，而且SBFE的抑菌效果明顯增加。

鑒于處理方式對沙棘酒皮渣抑制金黃色葡萄球菌的效果差異較明顯，結(jié)合沙棘籽中生物活性物質(zhì)[6，10-11]，考察了不同方式處理沙棘酒皮渣后的黃酮、多酚及多肽的含量，結(jié)果如表3所示。

由表3可見，沙棘酒皮渣水提液中多肽和黃酮含量明顯低于發(fā)酵液中，雖多酚含量差異顯著。發(fā)酵液與SBFE中各成分以黃酮量的差異最大，其次是多肽，差異量相對較小的為多酚。

3 討論

地衣芽孢桿菌屬（B.licheniformis）微生物所產(chǎn)蛋白酶，具有水解蛋白脂鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)脂及轉(zhuǎn)肽的能力[12]。楊碧霞等[11]認(rèn)為葡萄籽多肽對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的均有抑制效果，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，說明多肽中可能含有抑菌肽。曹群華等[10]認(rèn)為沙棘籽渣黃酮對大鼠體內(nèi)組織自由基的抑制作用優(yōu)于果渣黃酮；樊金玲等[6]認(rèn)為水和70%乙醇對沙棘籽中多酚的提取產(chǎn)率分別為13.5%和16.6%。孫君社等[12]認(rèn)為采用微生物菌株或生物酶作用原料，可提高產(chǎn)物中黃酮苷元含量達(dá)到85%以上。由此，采用地衣芽孢桿菌發(fā)酵沙棘酒皮渣的過程中，可能會促使組織間的黃酮溶出，而且可能通過生物方式提高了黃酮的生物活性，從而使發(fā)酵液的抑菌效果較水提液顯著提高。

由此，地衣芽孢桿菌對沙棘酒皮渣發(fā)酵，促使皮渣中蛋白質(zhì)水解，提高了發(fā)酵液的抑菌效果，但所水解的蛋白來源于沙棘組織還是沙棘酒發(fā)酵所用的酵母菌[13]，還有待于進(jìn)一步研究。SBFE中的抑菌物質(zhì)可能是多種成分的共同作用，生物性作用能否提高黃酮的生物活性也有待于進(jìn)一步研究，但處理方式很明顯地使抑菌成分的溶出量差異顯著。

4 結(jié)論

采用地衣芽孢桿菌發(fā)酵沙棘酒皮渣，提高了沙棘酒皮渣發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制效果，但對酵母菌、黑曲霉、灰霉菌的抑制效果不明顯。SBFE對金黃色葡萄球菌的MIC濃度為1.2mg/mL，而且SBFE中抑菌成分具有較高的熱穩(wěn)定性，其最佳抑菌pH為7.5。在SBFE的應(yīng)用過程中，若存在大于2%的葡萄糖會降低其對金黃色葡萄球菌的抑制效果，但在SBFE中加入大于0.5%的檸檬酸和小于8%的苯甲酸會顯著增強SBFE的抑菌效果。由此，為SBFE應(yīng)用于飲料中作為天然防腐劑提供了理論依據(jù)，但SBFE的組成和食品安全性有待于進(jìn)一步研究。沙棘酒皮渣發(fā)酵后的抑菌物質(zhì)可能是多種成分，發(fā)酵可使沙棘酒皮渣中多肽、多酚和黃酮等有效抑菌成分的濃度提高，增強對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

[1]高錦明，張鞍靈，李蕓生，等.沙棘黃酮化學(xué)研究的進(jìn)展[J].沙棘，1998，11（2）：34-40.

[2]張哲民，馬英才.前蘇聯(lián)開發(fā)利用沙棘資源取得成效的啟示[J]. 沙棘，1993，6（1）：45-46.

[3]張郁松，羅倉學(xué). 沙棘資源開發(fā)與沙棘黃酮提取[J]. 食品研究與開發(fā)，2005，26（3）：46-47.

[4]劉錫建，王艷輝，馬潤雨，等.沙棘果渣中總黃酮提取的研究[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報，2004，31（1）：18-21.

[5]徐振波，劉曉晨，李琳，等.金黃色葡萄球菌腸毒素在食源性微生物中的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技，2013，29（9）：2317-2324.

[6]樊金玲，丁霄霖.沙棘籽提取物抗氧化活性與酚類組成的研究[J].天然產(chǎn)物開發(fā)與研究，2006，18：529-534，554.

[7]魯偉，任國譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J]. 食品科學(xué)，2005，26（7）：169-171.

[8]趙玉琪，殷麗君.沙棘葉黃酮的提取及其對抗氧化性的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2006，27（4）：70-75.

[9]雷鳴鳴，沈異，周建全.沙棘的藥用成分及其對心血管系統(tǒng)影響的研究進(jìn)展[J].四川中醫(yī)，2004，22（9）：26-28.

[10]曹群華，瞿偉菁，黃曉青，等.沙棘籽渣和果渣中黃酮抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基作用[J]. 中成藥，2003，25（8）：670-673.

[11]楊碧霞，馮翠萍，張碩，等.葡萄籽多肽的制備及功能研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，31（6）：551-556.

[12]孫君社，殷麗君，顏廷和.銀杏黃酮甙元的生產(chǎn)方法：中國，2003153489·9[P].2005-02-16.

[13]李華，王華，袁 春龍，等. 葡萄酒 工藝學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2007：73-91.

Study on the antibacterial effect of sea buckthorn wine residue fermentation extraction on Staphylococcus aureus

JIAO Yang，LI Cai-xia，GAO Zheng-rui，GANG Li-juan，ZHANG Ai-ping*
（College of Agriculture and Biotechnology of Hexi University，Zhangye 734000，China）

The antibacterial effect of fermentation extraction（SBFE） on Staphylococcus aureus was studied in this article，which extracted from sea buckthorn wine pomace after being fermentated by bacillus licheniformis.It was showed that MIC of SBFE was 1.2mg/mL.The antibacterial result of SBFE performs was good in thermal stability，and the optimum pH was 7.5.In addition，the compounded SBFE could perform better with more than 0.5%citric acid or less than 8%benzoic acid，respectively，while solution with more than 2%of glucose could reduce the antibacterial effect of SBFE.In summary，antibacterial substances of sea buckthorn wine pomace fermented might be a synergic effect of various components.The concentration of peptides ， polyphenols ，and flavonoids increases significantly after fermentation ， which lead to a better antibacterial effect on Staphylococcus aureus.

sea buckthorn wine pomace；fermentation extracts；Staphylococcus aureus；antibacterial；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）20-0155-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.025

2014－01－15

焦揚（1973-），女，副教授，研究方向：應(yīng)用微生物。

* 通訊作者：張愛萍（1980-），女，講師，研究方向：食品營養(yǎng)。

河西學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)興項目。