鮟鱇皮膠原蛋白肽最佳制備工藝及自由基清除活性研究

楊會成，鄭 斌，廖妙飛，周宇芳，馬華威，相興偉，李八方

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.浙江省海洋開發研究院，浙江舟山 316021）

鮟鱇皮膠原蛋白肽最佳制備工藝及自由基清除活性研究

楊會成1，2，鄭 斌2，廖妙飛2，周宇芳2，馬華威2，相興偉2，李八方1，*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.浙江省海洋開發研究院，浙江舟山 316021）

研究提取鮟鱇（Lophius litulon）膠原蛋白肽的最佳制備工藝，測定魚皮基本成分和多肽的氨基酸組成，探討鮟鱇多肽組分體外自由基清除效果。結果表明，魚皮中粗蛋白占28.1%；胃蛋白酶添加量1%，料液比1∶20，酶解時間6h，酶解溫度5℃時，羥脯氨酸提取率為11.67%，鮟鱇膠原蛋白肽提取效果最佳；鮟鱇魚皮膠原蛋白肽在232nm處有紫外吸收峰，膠原肽 中 Gly（甘 氨酸）占 36.61%，Pro（脯 氨 酸）和 Hyp（羥 脯氨 酸）總 含 量 占 16.86% ，Phe（苯 丙 氨 酸）、Cys（半 胱氨酸）、His（組氨 酸）三 者 含量 均 低 于 1.1% ；鮟 鱇 魚 皮膠 原 蛋 白 肽 具 有 較強 的 還 原 能 力 且 對 O-2·（超 氧 陰 離 子 自 由 基）、DPPH·（二苯基苦酰肼基自由基）、·OH（羥自由基）具有一定的清除效果，清除能力與膠原蛋白肽的濃度呈正相關，濃度為10mg/mL時，對·OH、DPPH·、O-2·自由基的清除率和Fe3+還原力分別為70.48%、68.78%、48.33%和0.676。

鮟鱇魚，膠原蛋白肽，氨基酸，自由基，Hyp

鮟鱇魚（Lophius litulon）屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，分布于北太平洋西部，產于我國東海北部、黃海及渤海[1]。隨著近年來鮟鱇魚市場需求旺盛，產量和價格大幅增加，鮟鱇魚加工出口己成為我國的新興漁業。然而，在鮟鱇魚的加工中，大量魚皮被做為下腳料廢棄或者低值利用，造成污染環境和資源浪費[2]。

研究證實人體內氧化產生的自由基與人的衰老、癌癥、動脈硬化等多種疾病有關，其中尤以含氧自 由 基 為 最[3]，在 機 體 內 過 多 積 累 可 損 傷 生 物 大 分子，影響細胞的正常結構和功能[4-5]。目前，已有研究報道證實從水產動物中提取的多肽類物質具有較好的體內外抗氧化活性，并顯示了一定的應用前景[6-14]。但迄今有關鮟鱇魚皮膠原蛋白肽體外抗氧化研究的報道還較少。

本文以鮟鱇魚皮為原料，研究其魚皮組分，通過正交實驗酶解制備鮟鱇魚皮膠原蛋白肽，分析其氨基酸組成。利用鐵離子還原體系和O-2·、DPPH·、·OH三種代表性自由基體系實驗，研究鮟鱇魚皮膠原蛋白肽對自由基的清除效果以及體外抗氧化作用，以探索實現鮟鱇皮的高值化加工利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮟鱇魚原料 由浙江興業集團有限公司提供，原料去皮，去除雜物，于-18℃冷藏；胃蛋白酶 比活力1∶3000，上海源聚科技生物有限公司；其他的試劑 為國產分析純。

Micct-Q超純水器 日本Milli-por LIMITED公司；EYELA冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；CR21G高速冷凍離心機 HITACHI CENTRIFUGE；AL-104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；日立835-50氨基酸自動分析儀 日本日立公司；UV-2102C紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SK21-4數顯水浴鍋 天津歐諾儀器公司；海爾冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚皮基本組分測定[15]水分：直接干燥法測定；灰分：高溫爐550℃灼燒法測定；粗蛋白：微量凱氏定氮法測定；粗脂肪：索氏脂肪抽提法測定；總糖：苯酚-硫酸法測定。

1.2.2 魚皮膠原蛋白肽制備 工藝簡略流程：新鮮魚皮→預處理（0.1mol/L NaOH輔以磁力攪拌24h，水洗至中性，10%丁醇浸泡24h，洗至中性）→0.5mol/L醋酸浸提24h→0.9mol/L NaCl鹽析24h→蒸餾水透析（料液比為1∶15）→沉淀得膠原蛋白→酶水解（不同胃蛋白酶添加量、料液比、酶解時間和酶解溫度）→過濾→濃縮→產品凍干保存。

1.2.3 Hyp標準曲線制作 按照 ISO3496：1978（E）方法[16]略 有 修改 。Hyp標 準 品用蒸 餾 水 分 別 稀 釋 為1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μg/mL，以對二甲基氨基苯甲醛為顯色劑，采用比色法測定羥脯氨酸含量，并繪制標準曲線圖。

1.2.4 Hyp提取率計算 稱取1.0g鮟鱇魚皮粉，加入50mL濃度為6mol/L的鹽酸，105℃鼓風干燥箱中密封水解24h，蒸餾水定容至100mL。準確移取1mL該水解液，用NaOH溶液調節pH至6.0后蒸餾水定容至100mL，按1.2.3方法測定Hyp含量，計算出魚皮中Hyp總含量。量取10mL膠原蛋白肽提取液，按上述方法測定提取液中Hyp的含量，計算Hyp提取率。

Hyp提取率（%）=提取液中Hyp總含量/魚皮原料中Hyp總含量×100

1.2.5 酶解工藝篩選優化 基于單因素實驗結果，以酶解時間、料液比、胃蛋白酶加酶量、酶解溫度為因素參數，以Hyp提取率為評價指標，進行如表1中的L9（34）正交實驗，確定最佳酶解工藝。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 氨基酸組成測定 稱取一定量凍干的鮟鱇魚皮多肽，加入6mol/L HCl后真空封管，置于110℃烘箱密封水解24h后抽真空趕酸，定容至0.5mL，用氨基酸自動分析儀測定各氨基酸的含量，進樣量為50μL。

1.2.7 抗氧化能力測定 選取維生素C、茶多酚、BHA為對照樣品，體外實驗設置的濃度梯度分別為2、4、6、8、10mg/mL。

1.2.7.1 還原能力測定[17]取一定濃度的樣品，加入2.5mL pH6.6 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液（0.2mol/L）和2.5mL 體積分數1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20min后加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.5mL質量分數為0.1%的FeCl3，以A700nm波長處測定的比色值（ABS）表示樣品還原能力。

1.2.7.2 清 除O-2·能 力 測 定 采 用 鄰 苯 三 酚 自 氧 化法[14，18]，鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化，生成有色中間產物 和O-2·，O-2·對自 氧 化 有 催 化作 用 。具 體操作：取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL，置25℃水浴預熱20min，加0.1mL不同濃度的樣品，2.5mmol/L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中反應4min，立即用維生素C溶液終止反應，測A299nm值。以蒸餾水代替樣品做空白組，按下式計算清除率并求得IC50。

式中：A樣品、A空白分別為樣品和空白的吸光值。

1.2.7.3 清除DPPH·能力測定 采用DPPH·酶標儀法[19]，加 不 同 濃 度 的 樣 品 溶 液 100μL 和 1mmo1/L 的DPPH·甲醇溶液100μL于96孔酶標板中，振蕩30s，37℃保溫20min后在517nm波長下測定。每個樣品平行測定3次。按下式計算：

式中：Ap為樣品與1mmol/mL DPPH·反應后的吸光 值 ；Ac為 不 加 DPPH·時 樣 品 的 吸 光 值 ；Amax為 加DPPH·但不加樣品（以80%甲醇代替樣品）的吸光值。

1.2.7.4 清除·OH能力測定[20]取0.025mol/L pH7.4的磷酸緩沖液1mL，40μg/mL的番紅花紅1mL，供試樣品0.5mL，3%過氧化氫1mL（新鮮配制），0.945mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ） 1mL（新鮮 配 制），混合 后37℃水 浴中反應30min后，520nm處測定吸光度。空白組以0.5mL蒸餾水代替供試樣品，對照組以1.5mL蒸餾水代替EDTA-Fe（Ⅱ）和供試樣品，按下式計算清除率：

·OH清除率（%）=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100

式中：A樣品、A空白、A對照分別為樣品、空白和對照的吸光值。

2 結果與分析

2.1 鮟鱇魚皮基本組分

從表2可以看出，鮟鱇魚皮的水分含量很高，約占總重的70%，其次是粗蛋白占總重的28%，約為干物質總量的93%，粗脂肪的含量相比粗蛋白含量低。因此，鮟鱇魚皮是一種很好的膠原蛋白提取來源。

表2 鮟鱇魚皮的基本成分Table 2 Basic compositions of anglerfish skin

2.2 羥脯氨酸標準曲線

以羥脯氨酸的濃度為橫坐標，不同濃度下測定得到的羥脯氨酸A560值為縱坐標，繪制羥脯氨酸的標準曲線，結果見圖1。羥脯氨酸標準樣品的回歸方程為Y=11.7108X-3.5316（R2=0.9953）

圖1 羥脯氨酸標準曲線Fig.1 The standard curve of hydroxyproline

2.3 單因素實驗條件的確定

為增加鮟鱇魚皮膠原蛋白肽溶解度，提高提取率，采用胃蛋白酶處理提取膠原蛋白肽。實驗采用不同胃蛋白酶添加量、料液比、時間、溫度對魚皮酶解提取，以確定最佳工藝參數。

2.3.1 最佳胃蛋白酶添加量確定 實驗固定料液比1∶20，酶解時間6h，酶解溫度5℃，胃蛋白酶添加量分別取0.5%、7.0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，實驗結果見圖2。結果表明，當胃蛋白酶添加量為0.5%時，膠原蛋白肽液中Hyp的提取率最低，Hyp的提取率隨著酶添加量的增加而增加，在添加量為1.5%時，Hyp的提取率最大，隨后Hyp的提取率下降。雖然1.5%的胃蛋白酶添加量較1%的酶添加量時Hyp提取率高，但酶用量也較大，所以從純度和經濟方面考慮，1%的胃蛋白酶添加量應為最佳選擇。

2.3.2 最佳料液比確定 實驗固定胃蛋白酶質量分數1%，酶解時間6h，酶解溫度5℃，料液比分別取1∶5、1∶10、1∶20、1∶25、1∶30，實驗結果見圖3。結果表明，當料液比為1∶20時提取效果最好。隨著溶劑量增加，魚皮中Hyp的提取率增加，但到一定程度后，魚皮中Hyp的提取率降低，故確定最佳料液比為1∶20。

2.3.3 最佳溫度確定 實驗固定胃蛋白酶質量分數1%，料液比1∶20，酶解時間6h，酶解溫度分別設置為1、5、10、15、20、22℃，實驗結果見圖4。結果表明，當酶解溫度為5℃時提取效果最好。從圖4中可以看出，膠原蛋白肽在5℃時酶處理效果最好，過高或過低的溫度都會影響酶的活性，從而影響酶處理效果。

圖2 酶添加量對Hyp提取率的影響Fig.2 Effect of different addition of pepsin on Hyp extraction yield

圖3 料液比對Hyp提取率的影響Fig.3 Effect of different proportion on Hyp extraction yield

圖4 溫度對Hyp提取率的影響Fig.4 Effect of different temperature on Hyp extraction yield

2.3.4 最佳時間確定 實驗固定胃蛋白酶質量分數1%，料液比1∶20，酶解溫度5℃，酶解時間分別設置為1、2、3、4、5、6、7h，實驗結果見圖5。結果表明，當酶解時間為6h時提取效果最好。反應初期，酶解速率較大，膠原蛋白肽液中Hyp的提取率上升，但到達一定時間后，酶失去作用力，含量不再上升，故最佳酶解時間為6h。

圖5 時間對Hyp提取率的影響Fig.5 Effect of different time on Hyp extraction yield

2.4 最佳提取條件的確定

正交實驗結果及數據分析見表3。正交實驗極差（R）分析表明，對Hyp影響最大的是酶解溫度（D），依次是料液比（B）、加酶量（C）、酶解時間（A），最佳提取組合為A3B3C2D1，即胃蛋白酶質量分數1%，料液比為1∶20，酶解時間6h，酶解溫度5℃。

表3 正交實驗結果Table 3 Result analysis of orthogonal experiment

將正交實驗通過方差分析深入判斷實驗誤差和實驗條件對實驗效果的影響，探求所選用的因素中起主導作用的變異來源，方差分析結果見表4。由表4可以看出，酶解溫度對提取指標Hyp具有極顯著影響，其次是料液比，而酶解時間和酶加量影響較小。

表4 膠原蛋白肽提取率的方差分析Table 4 Analysis of variance on orthogonal experiment

將正交實驗篩選的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽最佳提取組合A3B3C2D1進行驗證實驗，結果發現，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽中Hyp提取率為11.67%。高于表3中其他組合的實驗結果。

2.5 氨基酸組成成分分析

最佳酶解提取工藝條件下，鮟鱇魚膠原蛋白肽的氨基酸組成和含量，如表5所示。

表5 鮟鱇多肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of Lophius litulon collagen peptides

鮟鱇多肽的氨基酸組分中，Gly、Pro、Hyp等與其性質密切相關的氨基酸含量較高。與其他來源的魚皮膠原蛋白一樣[21-22]，甘氨酸占36.61%，在鮟鱇膠原蛋白肽中含量最高，其中Pro和Hyp的含量占16.86%，而Phe、Cys、His含量極小，三者含量占有比例均不到1.1%。

2.6 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的紫外吸收光譜

將提取的鮟鱇多肽在200～400nm的近紫外光區進行連續波長掃描，結果見圖6。由圖6可知，鮟鱇多肽在200～250nm有紫外吸收，其最大的吸收波長為232nm。通常由于芳香族氨基酸的存在，樣品的紫外吸收強烈且最大紫外吸收峰多在280nm，而本實驗發現鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的最大紫外吸收峰并未出現在該波長位置，這可能與鮟鱇多肽中芳香族氨基酸含量較少有關。

圖6 鮟鱇多肽的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectrum of the collagen peptides from Lophius litulon skins

2.7 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化能力

2.7.1 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的還原能力 在低pH下，抗氧化劑將Fe3+還原成藍色的Fe2+，以Fe2+當量或者相對于標準抗氧化劑的能力來表示抗氧化活性[23]。室溫條件下，鮟鱇多肽的抗氧化活性與還原能力存在明顯的正相關性。

圖7為不同抗氧化劑（鮟鱇膠原蛋白肽、維生素C、BHA和茶多酚）對Fe3+的還原能力比較。相同濃度條件下，維生素C對Fe3+的還原能力最高；低濃度條件下（2～4mg/mL），鮟鱇膠原蛋白肽的還原能力低于各對照樣品；中高濃度條件下（6～10mg/mL），鮟鱇膠原蛋白肽的還原能力介于維生素C和BHA之間，略高于茶多酚。當膠原蛋白肽濃度為10mg/mL時，其還原能力為0.676。

圖7 樣品對Fe3+的還原能力Fig.7 Rreducing ability on Fe3+

2.7.2 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除O-2·的能力 超氧陰離子是生物有機體代謝過程中產生較強氧化能力的自由基，因此可以通過測定抗氧化劑對其清除效率來表征樣品的抗氧化能力[22]。不同抗氧化劑濃度與自由基的清除率關系如圖8所示。結果表明，對超氧陰離子清除率隨著測試抗氧化劑濃度的增高而增強，其中膠原蛋白肽濃度為10mg/mL時清除率為48.33%。

圖8 樣品清除O-2·能力Fig.8 Scavenging ability on O-2·

2.7.3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除DPPH·的能力 穩定自由基DPPH·乙醇紫色溶液在517nm波長有較強的吸收峰值，抗氧化劑能使這一吸收現象消失，顏色褪化，因此通過衡量樣品溶液吸光度的變化能夠快速靈敏的評價抗氧化劑的抗氧化能力[24-25]。不同濃度的抗氧化劑清除DPPH·自由基的結果如圖9所示，清除DPPH·的能力均隨實驗組濃度的增加而增大，膠原蛋白肽濃度為10mg/mL時清除率可達68.78%。濃度相同時（6～10mg/mL），各抗氧化劑對DPPH·的清除能力大小依次為茶多酚＞維生素C＞鮟鱇多肽＞BHA。

圖9 樣品清除DPPH·能力Fig.9 Scavenging ability on DPPH·

2.7.4 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除·OH的能力 羥基自由基（·OH）是需氧生物代謝過程中生成的具有強氧化能力的氧自由基，因此可以通過清除·OH能力來反映樣品抗氧化性的強弱[26-27]。不同抗氧化劑清除·OH能力如圖10所示。不同抗氧化劑清除·OH的能力均隨濃度的增加而增大，膠原蛋白肽濃度為10mg/mL時對自由基的清除率達70.48%，明顯高于維生素C和BHA。不同抗氧化劑在相同濃度條件下，清除能力大小依次為：鮟鱇多肽＞茶多酚＞BHA＞維生素C。由此可知，鮟鱇魚皮膠原蛋白肽具有較強的·OH清除能力。

圖10 樣品清除·OH能力Fig.10 Scavenging ability on hydroxyl free radica

3 結論

3.1 鮟鱇魚皮中水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、總糖分別占70.61%、0.32%、28.1%、0.42%、0.28%；鮟鱇魚皮可作為膠原蛋白及其膠原肽的重要來源。

3.2 鮟 鱇 魚 皮 膠 原 蛋 白 肽 的 最 佳 提 取 工 藝 為A3B3C2D1，即胃蛋白酶質量分數1%，料液比為1∶20，酶解時間6h，酶解溫度5℃。此條件下Hyp提取率為11.67%。

3.3 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽中Gly、Pro、Hyp等與其性質密切相關的氨基酸含量較高。其中Gly含量占36.61%，Pro和Hyp的總含量占到16.86%，而Phe、Cys、His三者含量不到1.1%。

3.4 鮟鱇皮膠原蛋白肽具有Fe3+還原能力和·OH、DPPH·和O-2·自由基清除作用，隨著膠原肽濃度的增加清除率也相應增大。樣品濃度為10mg/mL時，對·OH、DPPH·、O-2·自由基的清除率和Fe3+還原能力分別為70.48%、68.78%、48.33%和0.676。其中6～10mg/mL相同濃度下，對DPPH·清除能力的大小依次為茶多酚＞維生素C＞鮟鱇多肽＞BHA，膠原肽還原Fe3+能力介于維生素C與BHA之間，對·OH清除能力的大小依次為鮟鱇多肽＞茶多酚＞BHA＞維生素C。

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Study on optimal preparation process and free radical scavenging activity of collagen peptides from Lophius litulon skin

YANG Hui-cheng1，2，ZHENG Bin2，LIAO Miao-fei2，ZHOU Yu-fang2，MA Hua-wei2，XIANG Xing-wei2，LI Ba-fang1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316021，China）

Collagen peptides from Lophius litulon skin had been extracted by using pepsin with orthogonal design.The composition of Lophius litulon skin，amino acid composition and UV absorption of the collagen peptides were analyzed.And four representive free radical systems were selected to evaluate the free radicals scavenging effection of Lophius litulon skin collagen peptides in vitro.The results showed that the crude protein in skin was 28.1% ，the optimal preparation process of collagen peptides from Lophius litulon skin was under this condition，that the pepsin addition was 1% ，the ratio between fish skin and solvent was 1 ∶20，extracting for 6h at the temperature of 5℃，and the Hyp yield of extraction was 11.67%.Ultraviolet Spectrum and amino acid analysis on collagen peptides showed that the maximum absorption peak was being 232nm and the proportion of Gly was 36.61%，Pro with Hyp was 16.86%，the proportion of Phe，Cys and His were less than 1.1%respectivly. The collagen peptides showed a certain capacity on free radical scavenging and reducibility ，which was positive correlation with concentration of collagen peptides.The free radical scavenging rate of·O，DPPH·，O-2· and reducibility of Fe3+respectivly were 70.48% ， 68.78% ， 48.33%and 0.676 at the collagen peptides concentration of 10mg/mL.

Lophius litulon；collagen peptides；amino acid；free radicals；Hyp

TS201.1

A

1002-0306（2014）20-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.026

2013－05－02

楊會成（1982-），男，博士研究生，研究方向：海洋生物資源開發與利用。

* 通訊作者：李八方（1953-），男，教授，主要從事海洋生物活性物質方面的研究。

浙江省廳市 會 商重 大 項 目（2011C02003）；“ 十 二五”農 村領域國家科技支撐計劃課題（2012BAD28B05-02）；舟山市重大海洋類項目（2011C21059）。