復合酶法水解小麥面筋蛋白的研究

丁志剛，高紅梅，潘冬梅

（安徽科技學院，安徽鳳陽 233100）

復合酶法水解小麥面筋蛋白的研究

丁志剛，高紅梅，潘冬梅

（安徽科技學院，安徽鳳陽 233100）

小麥面筋蛋白由于其溶解性較差，限制了其應用，實驗利用酶法水解能有效提高小麥面筋蛋白的溶解度。通過單因素實驗及正交實驗優(yōu)化了堿性蛋白酶與中性蛋白酶復合水解小麥面筋蛋白的最佳工藝條件。實驗結果表明：復合酶配比（堿性蛋白酶∶中性蛋白酶）為5∶5，水解溫度為55℃，復合酶濃度為1.0%，底物濃度為5%，水解初始pH為8.0，水解時間為3.5h時面筋蛋白的水解度最高，水解度可達14.6%。

面筋蛋白，復合酶，水解，水解度

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉，含有75%以上的蛋白質，其蛋白構成主要為谷蛋白和醇溶蛋白[1]。谷蛋白富含谷氨酰胺（Gln）和胱氨酸（Cys），是由多肽鏈通過分子間二硫鍵連接而成的蛋白；麥醇溶蛋白只含有分子內二硫鍵。谷朊粉吸水后所形成的濕面筋具有網(wǎng)狀結構，從而使其具有優(yōu)良的延伸性、成膜性、黏彈性、熱凝固性等，在食品工業(yè)中具有廣泛用途。谷朊粉蛋白質含量非常高，氨基酸也較為均衡，但因缺乏賴氨酸而使其生物價較低。可通過與富含賴氨酸的動物性蛋白混合食用，從而使各必需氨基酸構成均衡，以達到蛋白互補的目的。谷朊粉中還含有較高的鈣、磷、鐵等礦物質，特別是鈣含量遠高于雞蛋、牛肉等動物性食品，能夠很好地滿足人們對健康飲食的需求。隨著對小麥面筋蛋白功能特性等應用的拓展，小麥面筋蛋白的低溶解性，一直是科學家們亟待解決的難題。據(jù)研究，小麥面筋蛋白的發(fā)泡性、凝膠形成性、水合性、分散性和乳化性等各種功能性質的發(fā)揮都與其溶解性密切相關[2-4]。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，小麥資源豐富，但是對小麥面筋蛋白產(chǎn)品的開發(fā)利用率卻遠遠低于西方發(fā)達國家。因此，對小麥面筋蛋白溶解性進行深入的研究，找出能高效增加面筋蛋白溶解度的方法是很有必要的。

本文采用復合酶水解法，即利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶按照一定的比例，在適宜水解條件下進行面筋蛋白的水解，旨在探究復合酶法水解小麥面筋蛋白對其溶解度的影響，為研究面筋蛋白的溶解性、拓展其應用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 徐州得隆生物科技有限公司提供；中性蛋白酶 BR，中國醫(yī)藥集團上海試劑公司（酶活60000U/g）；堿性蛋白酶 BR，北京奧博星生物技術有限責任公司（酶活200000U/g）；其他分析類試劑 均為分析純。

pHS-3D精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；79-1磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 水解方法研究

1.2.1 谷朊粉的預處理 堿處理法[5]：預先配制好濃度為0.01mol/L的NaOH溶液，按照一定的量，將谷朊粉分散在配制好的NaOH溶液中，配制成蛋白質濃度為5%的懸濁液，然后，調整懸濁液溫度為60℃，并采用磁力攪拌的方法，持續(xù)攪拌30min，備用。

1.2.2 谷朊粉酶法水解工藝 將經(jīng)預處理后的小麥面筋蛋白用1mol/L NaOH溶液（或HCl溶液）調節(jié)pH至所需值，然后加入一定量的酶進行水解反應，在反應過程中連續(xù)測定反應液的pH，并以0.1mol/L NaOH溶液維持反應液的pH恒定，采用pH-Stat法測定水解度變化。反應結束后，將反應液在100℃水浴條件下滅酶活5min，對實驗所得數(shù)據(jù)進行處理分析。

1.2.3 復合酶水解效果 在進行復合酶水解面筋蛋白實驗之前，查閱相關文獻資料得堿性蛋白酶和中性蛋白酶的最佳水解工藝條件[6-8]。實驗條件為底物濃度5%，酶濃度（E/S）1%，初始pH、反應時間、反應溫度，依據(jù)兩種酶的最優(yōu)作用條件設置。測定堿性蛋白酶和中性蛋白酶單獨水解小麥面筋蛋白時的水解度，為使用復合酶水解提供有利數(shù)據(jù)。

1.2.4 單因素實驗設計 依據(jù)酶學原理及相關資料選擇復合酶使用配比（5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶5）、水解反應進行時間（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）、反應溫度（40、45、50、55、60℃）、復合酶的濃度（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、面筋蛋白底物液濃度（3%、4%、5%、6%、7%）、反應初始pH（7.5、8.0、8.5、9.0）6個因素進行單因素實驗，找出各因素的最佳作用范圍。進行單因素實驗時擬定基礎條件：復合酶配比為5∶4、酶濃度為1.0%、反應時間為3.5h、反應溫度為55℃、底物濃度為5%、反應初始pH為8.0，在研究相關單因素時只改變此因素水平值，其他因素按基礎條件值固定不變，在研究下一單因素時，已研究的單因素取最優(yōu)值進行實驗。

1.2.5 正交實驗設計 在對單因素實驗結果分析總結的基礎上，選擇在復合酶水解面筋蛋白過程中對實驗結果影響較大的四個因素，設計四因素三水平的正交實驗，對實驗工藝條件進行進一步優(yōu)化，使復合酶水解面筋蛋白能得到較好的結果。正交設計因素水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 指標測定 水解度的測定：采用pH-Stat法測定試樣水解度[9]。水解開始時，調節(jié)反應體系到蛋白酶最適pH，反應過程中用濃度為0.1mol/L的NaOH調節(jié)pH并使其保持恒定，記錄所使用的堿液量，計算水解度DH：

式中：V—NaOH的體積，mL；C—NaOH的濃度，mol/L；α—水解系數(shù)，表示α氨基的平均解離度；M—蛋白質的質量，g；8.38—每1g原料蛋白質中肽鍵的毫摩爾數(shù)；本實驗中pKa=7，C=0.1mol/L；α=10pH-pKa/（1+10pH-pKa）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用 SPSS13軟件進行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 兩種蛋白酶各自最佳水解條件 實驗前采用國家標準方法分別測定選用堿性蛋白酶及中性蛋白酶的酶活。堿性蛋白酶活力為182000U/g；中性蛋白酶活力為63000U/g。

依據(jù)所用蛋白酶試劑說明分別選取其最適作用條件，測定在此條件下各種酶單獨作用對小麥面筋蛋白的水解程度。實驗數(shù)據(jù)記錄見表2。由表2中數(shù)據(jù)可知，堿性蛋白酶在水解面筋蛋白時，當實驗條件采用1.0%的酶濃度、5%的面筋蛋白底物濃度、初始pH為9.0，溫度為60℃時，所測得的水解度為13.5%左右；中性蛋白酶的水解度則相對較低，為7.3%。

由于面筋蛋白的低溶解性，在實驗過程中，增大反應前面筋蛋白的溶解度對酶解反應有很大影響。為后續(xù)操作實驗方便，本實驗中蛋白酶的添加量在測定了酶活的基礎上按酶與底物質量百分比進行添加（后續(xù)不再說明）。

圖1 復合酶配比對水解度的影響Fig.1 Composite enzyme proportion on the influence of the degree of hydrolysis

表2 兩種蛋白酶單獨水解面筋蛋白的條件及結果Table 2 Two protease hydrolysis wheat gluten protein alone the condition and result

2.1.2 復合酶配比對面筋蛋白水解度的影響 依據(jù)方法1.2.4條件進行水解實驗，研究中性蛋白酶與堿性蛋白酶質量比對面筋蛋白水解度的影響，其結果如圖1所示。

由圖1可知，復合酶法水解小麥面筋蛋白的水解度隨著復合酶的配比的變小而逐漸增大，當復合酶配比為5∶4時，水解度達到最大。由此可得，在水解過程中，堿性蛋白酶起主要作用，堿性蛋白酶的使用量的大小對水解過程影響較大。依據(jù)實驗結果，確定復合酶的最佳配比為5∶4。

2.1.3 溫度對面筋蛋白水解度的影響 實驗過程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標，反應溫度分別取40、45、50、55、60℃，結果如圖2所示。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Temperature on the influence of the degree of hydrolysis

由圖2可知，隨反應溫度的增加，面筋蛋白的水解度也隨之增加，當溫度達到55℃時，水解度達到最大值，之后，隨著溫度繼續(xù)上升，水解度反而有所減小。出現(xiàn)這樣結果的原因為在使用復合酶法水解小麥面筋蛋白時，堿性蛋白酶和中性蛋白酶都有其最適宜的酶活溫度范圍。其中，堿性蛋白酶的最適溫度為60℃左右[13]，中性蛋白酶的最適水解溫度為50℃左右[11]。當溫度高過一定范圍時，酶分子的空間結構會因為分子能量的增大而發(fā)生變化，酶的活性會減弱甚至喪失。因此，確定復合酶的最佳水解溫度為55℃。

2.1.4 復合酶濃度對面筋蛋白水解度的影響 實驗過程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標，復合酶濃度分別取0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，實驗結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著復合酶濃度的增大，面筋蛋白的水解度先呈上升狀態(tài)，復合酶用量的增加可以提高反應過程中酶與底物接合的幾率，從而能有效增加面筋蛋白的水解度。當復合酶濃度為1%（E/S）時，再繼續(xù)增大濃度，水解度上升趨勢基本保持穩(wěn)定，數(shù)據(jù)變化很小。這是因為當復合酶的用量過大時，會在一定程度上干擾酶解物的組成[10]，而且，酶用量的增大會大大增加成本。另外，由于蛋白酶自身特殊的感官性狀，帶有很強的臭味。所以，在水解小麥面筋蛋白時，在保證一定水解度的情況下，蛋白酶的使用量也應該盡量少一點，防止水解后的多肽物質帶有不良氣味，影響產(chǎn)品的感官評價。因此，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，確定復合酶的使用1%（E/S）量時效果最佳。

2.1.5 底物濃度對面筋蛋白水解度的影響 實驗過程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標，底物濃度為變量，結果如圖4所示。

圖3 復合酶濃度對水解度的影響Fig.3 Composite enzyme concentration on the influence of the degree of hydrolysis

圖4 底物濃度對水解度的影響Fig.4 Substrate concentration on the influence of the degree of hydrolysis

由圖4可知，在底物濃度小于5%時，面筋蛋白的水解度隨著底物濃度的增加而逐漸增大；當?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時，水解度變化范圍較小。這是由于當?shù)孜餄舛容^低時，限制反應的因素是底物濃度，此時酶是充足的；當?shù)孜餄舛炔粩嘣龃蟮揭欢ㄖ禃r，加入到反應液中的復合酶分子已全部與底物結合，因此，再增大底物濃度也無法提高面筋蛋白的水解度。而且，由于面筋蛋白難溶于水，當濃度過大時會造成面筋蛋白分散困難[11-12]，甚至集結成團。故確定最佳底物濃度為5%。

2.1.6 反應時間對面筋蛋白水解度的影響 參照方法1.2.4條件，以水解度為指標，不同時間的結果如圖5所示。

圖5 反應時間對水解度的影響Fig.5 Reaction time on the influence of the degree of hydrolysis

由圖5可得，在反應時間小于3.5h時，面筋蛋白的水解度是一直處于上升狀態(tài)的，當達到3.5h時水解度達到最大。故確定最佳水解時間為3.5h。

2.1.7 反應初始pH對面筋蛋白水解度的影響 實驗過程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標，反應初始pH分別設計為7.5、8.0、8.5、9.0，實驗結果如圖6所示。

圖6 反應初始pH 對水解度的影響Fig.6 Reaction initial pH of the influence of the degree of hydrolysis

由圖6可知，面筋蛋白水解度的隨反應液初始pH的變化趨勢是先增大后減小。當pH在8.0附近時水解度達到最大值。隨反應液初始pH繼續(xù)增大時，水解度降低。這是因為，蛋白酶有其最適的pH范圍，當pH過大時已有部分中性蛋白酶發(fā)生變性，從而降低了復合酶的活性，影響水解度的大小。故確定最佳水解液初始pH為8.0。

2.2 復合酶法水解小麥面筋蛋白正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，選取對面筋蛋白水解度影響較大的4個因素，設計4因素3水平正交實驗，依據(jù)正交實驗組合進行水解實驗，其結果如表3所示，分析結果如表4所示。

表3 正交實驗結果與分析表Table 3 Orthogonal test results and analysis table

表4 正交實驗模型的顯著性分析表Table 4 Orthogonal experimental model significance analysis sheet

由表4可知，模型的F值為78.16，p值為0.0127，大于在0.05水平上的F值，由此可知，模型有效，此次評定的結果是可靠的。比較F值大小：FA＞FB＞FC，F(xiàn)值越大，影響作用越大，各因素對結果的影響程度大小的次序為A＞B＞C＞D。由表3極差分析結果可得面筋蛋白水解度最高的最優(yōu)組合是A2B2C3D2，由于該組合實驗在正交表中并未出現(xiàn)，因此進行了相應的驗證實驗，其結果如表5所示。

表5 驗證實驗結果Table 5 Results of verification test

由表5可知，理論最優(yōu)組合條件下，面筋蛋白的水解度最高為14.6%，故A2B2C3D2為最優(yōu)組合條件。

3 結論

以水解度為指標，通過研究復合酶法水解谷朊粉的工藝，經(jīng)實驗研究得在采用酶配比（堿性蛋白酶∶中性蛋白酶）為5∶5，水解溫度為55℃，復合酶濃度（E/S）為1.0%，底物濃度為5%，水解初始pH為8.0，水解時間為3.5h時面筋蛋白的水解度最高，可達14.6%。

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表6 長江刀鱭、黃河刀鱭與東海刀鱭肉核苷酸及味精當量TAVsTable 6 Comparison of TAVs of nucleotides and EUC in Yangtze River，Yellow River and Seawater Coilia ectenes Jordan cooked meat

3 結論

通過對比長江刀鱭和黃河刀鱭這兩種洄游刀鱭與海水刀鱭的滋味成分差異，我們發(fā)現(xiàn)刀鱭的洄游使得其體內的無機離子含量下降，同時ATP分解產(chǎn)物的不斷積累，這些呈味核苷酸使刀鱭的滋味更為鮮美，導致了兩種洄游刀鱭與東海刀鱭的滋味產(chǎn)生差異。三種刀鱭的味精當量值均遠高于閾值，這可能是刀鱭味道鮮美的原因之一，長江刀鱭和黃河刀鱭味精當量的滋味強度值均高于東海刀鱭，表明洄游的刀鱭更為鮮美。

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Study on hydrolyze wheat gluten protein by methods of composite enzymatic

DING Zhi-gang，GAO Hong-mei，PAN Dong-mei
（Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China）

Wheat gluten protein had a poor solubility that limited its application.Using enzyme could improve the solubility of wheat gluten protein effectively.The optimal technological conditions of hydrolysate which mixed by alkaline protease and neutral protease via were optimized single factor test and orthogonal test.The results showed that the wheat gluten protein could got the hightest degree of hydrolysis 14.6%when it undere the follow conditions ： the ratio of composite enzyme （ alkaline protease ∶neutral protease ） was 5 ∶5 ， hydrolysis temperature was 55℃ ，the concentration of compound enzyme was 1.0% ，the concentration of substrate was 5%，the initial pH of hydrolysis was 8.0，the time of hydrolysis was 3.5h.

gluten protein；composite enzyme；hydrolysis；degree of hydrolysis

TS211.2

A

1002-0306（2014）20-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.033

2014－04－28

丁志剛（1978-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

安徽省教育廳科研課題（KJ2013Z043，KJ2012B060）