α-蒎烯的發酵動力學模型

任 萌，高國富，咸 漠，楊建明，*

（1.南京農業大學生命科學學院，江蘇南京 210095；2.中國科學院生物基材料重點實驗室，中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101）

α-蒎烯的發酵動力學模型

任 萌1，2，高國富1，*，咸 漠2，楊建明2，*

（1.南京農業大學生命科學學院，江蘇南京 210095；2.中國科學院生物基材料重點實驗室，中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101）

以α-蒎烯生產菌株YJM28為供試菌株，對其發酵動力學特征進行了研究。通過對Logistic等方程進行了最優參數估計和非線性擬合，得出了α-蒎烯的發酵動力學模型及相關參數。并且對動力學模型的擬合曲線分析可知，發酵實驗值與模型預測值能夠較好的吻合，說明所建立的發酵動力學模型能夠較好的反應α-蒎烯的發酵過程。

α-蒎烯，發酵動力學模型，擬合

α-蒎烯是一種重要的天然產物，主要存在于松節油當中，廣泛應用于農藥、香料、醫藥以及精細有機合成工業[1-2]。利用微生物法生產α-蒎烯具有原料來源廣泛，生產不受季節限制，生產周期短以及易擴大生產等優點。由于遺傳背景清楚，基因操作簡單，大腸桿菌被廣泛應用于微生物發酵領域中[3-4]，利用重組后的大腸桿菌進行α-蒎烯的生產研究報告較少，而有關其發酵過程中的生長特性、發酵動力學分析方面研究未見文獻報道。

本文以重組大腸桿菌YJM28作為實驗菌株，研究 了 該 菌 株 的 發 酵 動 力 學 性 質 。 利 用 Logistic 及Luedeking-Piret方程建立了該菌的菌體生長、產物合成以及底物消耗的動力學模型。通過Matlab 2012軟件進行實驗數據處理，擬合出所有的模型參數，建立發酵動力模型[6]。最后對模型預測值與實驗真實值之間進行比較，驗證所得模型的可靠性。本文目的是初步確定YJM28的發酵動力學模型，為進一步優化及放大提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組大腸桿菌YJM28（recombination Escherichia coli YJM28） 本實驗室構建及保存；氨芐青霉素 北京索來寶公司；氯霉素 購自北京東勝泰博科技有限公司；誘導劑IPTG 購自合肥BIOSHARP公司；蛋白胨 天津大茂試劑有限公司；其余試劑 均為國藥公司分析純試劑。

種子培養基 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，冷卻后使用；發酵培養基（1L） 檸檬酸鐵銨0.15g，K2HPO4·3H2O 4.9g，C6H8O7·H2O 0.525g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，冷卻后使用；葡萄糖（20g/L）、MgSO4（1mol/L） 115℃滅菌30min，冷卻后4℃保存；氨芐青霉素（100mg/L）、氯 霉 素（34mg/L）、IPTG溶 液（20mg/mL） 過 濾 滅 菌后-20℃保存；微量元素溶液（0.37g（NH4）6Mo7O24·4H2O，0.29g ZnSO4·7H2O，2.47g H3BO4，0.25g CuSO4·5H2O，1.58g MnCl2·4H2O，用 蒸 餾 水 定 容 至 100mL）過 濾 滅菌后4℃保存。

Cary-50紫外-可見分光光度計 美國瓦里安技術有限公司；SP-6890氣相色譜儀 山東魯南瑞紅化學分析儀器有限公司；IS-RDS3恒溫振蕩器 美國CRYSTAL公司；1-14臺式高速離心機 美國Sigma公司；SBA-40C生物傳感器 山東省微生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養 用無菌牙簽挑取單克隆于3mL LB培養液中活化，再以5%接種量接入40mL LB液體培養基中，37℃，180r/min培養4h后準備轉接。

1.2.2 發酵培養 按1%接種量轉接上一步活化好的種子至590mL厭氧培養瓶中，37℃，180r/min培養至OD600達到0.6～0.9，接著，以終濃度為0.04mmol/L的IPTG誘導，誘導后加瓶塞并將培養溫度調至30℃，轉速不變，連續發酵48h[5]。

1.2.3 α-蒎烯發酵液的檢測 發酵液在10000r/min下離心1min，取上清液稀釋，采用SBA-40C生物傳感器分析儀分析葡萄糖濃度；細胞密度用紫外-可見風光光度計測定OD600，1個OD600菌體密度相當于0.2g/L菌體干重；發酵產物采用SP-6890氣相色譜儀進行檢測（柱型號HP-INNOWAX；檢測器FID，200℃；進樣量1mL搖瓶上空氣體；柱溫升溫程序50℃保溫0.5min，然后4℃/min升溫至70℃，再以20℃/min升溫至250℃，保溫10min；氣化室200℃；Rt≈3.75min）。

1.2.4 數 據 處 理 所 得 實 驗 結 果 在 Logistic 以 及Luedeking-Piret方 程 基 礎 上 ，建 立 α - 蒎 烯 產 生 菌YJM28發酵過程中菌體生長、產物形成、底物消耗的動力學模型[6]。應用Matlab 8.0軟件處理實驗數據，擬合模型及其相關參數，建立發酵動力學模型。

2 結果與討論

2.1 α-蒎烯發酵過程代謝變化特征

圖1 YJM28生產α-蒎烯發酵過程曲線Fig.1 Fermentation curve of YJM for fermentation α-pinene

YJM28生產α-蒎烯整個發酵過程代謝變化如圖1所示。從圖1中可以看出，菌體的生長曲線呈現出典型的S型曲線，供試菌株的延滯期較短，菌體生長較為迅速，0～4h為菌株的延遲期，菌體生長較為緩慢，4～16h為對數生長期，菌體生長迅速，20h達到穩定期，菌體生長趨于穩定，菌濃增加變小，在發酵24h時菌體干重達到0.43g；發酵產物α-蒎烯濃度變化過程與細胞生物量變化趨勢稍有不同，α-蒎烯濃度在20h達到最大，產物濃度達到32.8mg/L，此后稍有下降，但是較為緩慢，仍可在較高水平維持一段時間。從菌株生長和產物合成曲線可以看出，細胞生長伴隨著產物的合成，待菌體生長達到穩定后，產物合成也趨于穩定。因此可以推測YJM28菌株生產α-蒎烯的發酵類型為生長部分偶聯。從限制性底物消耗曲線可知葡萄糖利用與細胞生長基本成對稱關系[7]。

2.2 動力學模型的建立

發酵動力學模型一般由3部分組成：菌體生長動力學模型、產物形成動力學模型、底物消耗動力學模型。按照建模方法來分，可以將動力學模型分為三類：結構模型、半經驗模型以及經驗模型。目前，國內學者所構建的多屬于經驗或者半經驗模型。其中，半經驗模型建模方式較為簡單，易于分析，故此應用范圍較廣。建模目的是為了實現發酵過程控制的最優化[8]。

2.2.1 菌體生長動力學模型 描述微生物生長動力學的模型很多，以Monod方程和Logistic方程最為簡單常用[7]。前者是一種近乎理想的模型，它不考慮菌體濃度的增加對菌體生長的抑制作用，主要用來描述非抑制性單一底物限制下的細胞生長。后者作為典型的S型曲線，能夠較好地反應發酵過程中因菌體濃度增加對自身生長造成的影響，能夠較好地擬合發酵過程中的菌體生長規律。Logistic方程形式如下：

其中：μmax是最大生長速率（h-1）；X表示菌體干重（g/L）；t是發酵時間（h）。在發酵初始，當t=0時，此時菌濃X遠小于Xm，因此X/Xm項可以忽略不計，方程表示菌體呈指數形式生長；當處于穩定期，X=Xm，方程表示菌體停止生長。對式1進行積分，可得

式（1）是YJM28菌體發酵過程中的菌體生長動力學模型表達方程，式（2）是其積分形式。

2.2.2 產物形成動力學模型 由于發酵產物形成復雜，Gaden[9]將產物形成與細胞生長之間的關系分為3類：I類發酵，產物形成于細胞生長相偶聯；II類發酵，產物形成與細胞生長部分偶聯；III類發酵，產物形成與細胞生長不偶聯。為此，Luedeking和Piret[10]總結了下述公式來描述產物形成與細胞生長的關系：

其中，α表示與菌體生長相關的產物生成系數，β表示與菌體量相關的產物生成系數。當α≠0，β=0時表示產物形成與生長偶聯；當α，β≠0時，產物與生長部分偶聯；α=0，β≠0時，產物與生長不偶聯。根據圖1可以看出，YJM28應該屬于II類發酵，是菌體生長與產物合成部分偶聯，可以用Luedeking-Piret方程表示[11]。聯合式（1），（2），（3）并積分得到如下公式：

其中，P：產物α-蒎烯濃度（mg/L）；Po：產物的初始濃度（mg/L）；α：生長偶聯系數（mg·L-1）；β：生長偶聯系數（L·mg-1）。

當Po=0，Xo對產物的影響忽略不計，式4可簡化為：

2.2.3 底物消耗動力學模型 根據物料守恒原理，限制性底物消耗主要用于三部分，即：菌體的生長、產物的合成以及維持細胞自身的代謝。由于α-蒎烯發酵過程中只有底物葡萄糖作為主要能量來源在隨著發酵時間延長被不斷消耗，因此，選擇建立在單一限制性底物基礎上的底物消耗動力學方程進行底物消耗動力學模型的建立，該方程可用Luedeking-Piret-Like方程[9]定量表示：

2.3 模型參數求解

采用麥夸特算法，以誤差平方和最小為目標，通過Matlab軟件中cftool工具箱進行非線性擬合，獲得參數值[12]。根據發酵結果獲得模型參數的初步估計值，不斷擬合，直至得到全局收斂的最優化參數估計[13]。結果見表1。

根據表1結果，可得α-蒎烯發酵動力學模型為：

菌體生長動力學模型：

產物合成動力學模型：

底物消耗動力學模型：

2.4 擬合曲線分析

為進一步分析模型可靠性，運用軟件得到的α-蒎烯發酵過程擬合曲線如圖2～圖4所示。圖中實線代表模型預測值，虛線則表示實驗測試值。

由圖2～圖4可以看出，曲線擬合結果較為理想，并且從菌體生長、產物合成、底物消耗的實驗測試值與模型預測值隨時間變化曲線上看，兩者比較接近，經過計算，誤差都在5%之內，表明動力學模型選擇正確，模型擬合良好，能夠真實的反映α-蒎烯的發酵過程。

圖2 α-蒎烯分批發酵細胞生長實驗值與模型計算值的比較Fig.2 Comparison of the predicted data with experimental data on biomass growth

圖3 產物形成模型計算值與實驗值比較Fig.3 Comparison of the predicted data with experimental data on alpha-pinene yield

圖4 底物消耗模型計算值與實驗值比較Fig.4 Comparison of the predicted data with experimental data on substrate consumption

表1 發酵動力學模型估計值Table 1 Estimated values of kinetics model of fermentation

3 結論與討論

由于微生物發酵整個過程包含有許多因素，例如生長、繁殖、維持、死亡、溶胞等，因此工程上的理論在應用之前要進行合理的簡化，也就是說需要采用特定的模型來描述[14]。在分批發酵過程當中，一般采用均衡生長的非結構模型，即菌體細胞隨著生長時間的延長，胞內各組分以相同比例增加，不考慮外界環境對菌體組成的影響[15]。本實驗建立的各種模型就是基于以上假設而定。

本實驗對重組大腸桿菌YJM28的菌體生長、α-蒎烯合成以及基質消耗的動力學進行了研究。結果表明，構建的模型基本真實的反映了菌體發酵的過程變化，尤其是菌體生長的模型擬合較好。在發酵前期，產物合成以及底物消耗的模擬值與實驗值有較小的偏差。推測可能是實驗條件所限，由于產物是氣體形式存在于厭氧搖瓶發酵尾氣當中，發酵過程中不追加葡萄糖，初始葡萄糖濃度較低以保持菌體在生長的初期生長速率不能過快，造成后期在誘導階段菌體產物合成能力下降[16]。因此，在描述α-蒎烯產生時不能單純的只考慮細胞生物量，還必須考慮以上諸因素的影響，才能不斷的修正所建立的動力學模型使之能更真實的描述發酵過程。

利用麥夸特算法，以誤差平方最小為目標，通過Matlab軟件中cftool工具箱進行非線性擬合，可以獲得待解參數。根據發酵結果獲得模型參數的初步估計值，經過不斷擬合直至得到全局收斂的最優化參數估計，通過非線性擬合求解得到參數數值。而且從菌體生長、產物合成以及底物消耗與時間關系曲線上看，動力學模型選擇正確，擬合效果良好，較真實的反映了α-蒎烯的發酵全過程。

[1]李凝. 蒎烯 化學性 質的 應 用[J]. 廣 西化 工，2000，29（1）：37-38.

[2]Meylemans H A ，R L Quintana， B G Harvey.Efficient conversion of pure and mixed terpene feedstocks to high density fuels[J].Fuel，2012，97：560-568.

[3]Jian-ming Yang，Mo Xian，Si-zheng Su，et al.Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVA pathway and isoprene synthase in E.coli[J].Plos One，2012，7（4）：1-7.

[4]Jiang M ， Chen X ， Liang L et al.Co-expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase acid and nicotinic phosphoribosytransferase for succinate production in engineered Escherichia coli[J].Enzyme Microb Technol，2014，56：8-14.

[5]Jian-ming Yang，Qing-juan Nie，Meng Ren，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alphapinene[J].Biotechnol for Biofuels，2013，6：60.

[6]臧春榮，夏鳳毅. 微生物動力學模型[M]. 北京：化學工業出版社，2003.

[7]Bouvile M.Fermentation kinetics including product and substrate inhibitors plus biomass death：A mathematical analysis [J].Biotecnol Lett，2007，29：737-741.

[8]田雪，解鑫，周曉杭，等.地衣芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶分批發酵動力學模型[J]. 中國農學通報，2013，29（18）：193-199.

[9]Elmer L Gaden J.Fermentation Process Kinetics[J].Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering，1959，1（4）：413-429.

[10]Robert Luedeking，Edgar L Piret.A Kinetic study of the lactic acid fermentation batch process at controlled pH[J]. Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering，1959，1（4）：393-431.

[11]Colombie S，Malherb S，Sablayrolles J M.Modeling alcoholic fermentation in enological conditions：Feasibility and interest[J]. Am J Enol Vitic，2005，56：238-245.

[12]Jessica L Linville，Miguel Rodriguez Jr，Jonathan R Mielenz et al.Kinetic modeling of batch fermentation for populus hydrolysate tolerant mutant and wild type strains of Clostridium thermocellum[J].Bioresource Technology，2013，147：605-613.

[13]Jo?o Moreira Neto，Daniella dos Reis Garcia，Sandra Marcela Go’mez Rueda，et al.Study of kinetic parameters in a mechanistic model for enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse subjected to different pretreatments[J].Bioprocess Biosyst Eng，2013，36：1579-1590.

[14]程新，夏海林，黃林，等.紅曲霉JR發酵動力學模型的建立[J]. 江西農業大學學報，2010，32（3）：590-594.

[15]Ma L， Li C， Yang Z et al.Kinetic studies on batch cultivation of Trichoderma reesei and application to enhance cellulase production by fed-batch fermentation[J].J Biotechnol，2013，166（4）：192-197.

[16]Mitchell D A，Meien O F，Krieger N，et al.A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and in traparticle phenomena in solid state fermentation[J]. Biochem Eng J，2004，17：15-26.

Kinetic models for alpha-pinene fermentation

REN Meng1，2，GAO Guo-fu1，*，XIAN Mo2，YANG Jian-ming2，*
（1.School of Life and Sciences，Nan Jing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.CAS Key Laboratory of Bio-based Material，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China）

The dynamic models for alpha-pinene fermentation by Escherichia coli were studied.The kinetic models for cell growth ， alpha-pinene production and substrate consumption were proposed with Logistic equation ， Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret-Like equation though the optimal parameters estimation and nonlinear least-squares fitting method.The observed and estimated values of the models were in a good agreement， the result showed that the models could provide a reasonable description for the fermentation process of alpha-pinene.

α-pinene；fermentation kinetic model；fit.

Q851

A

1002-0306（2014）20-0196-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.034

2014－01－15

任萌（1988-），男，碩士研究生，研究方向：生物活性物質資源。

* 通訊作者：高國富（1963-），男，副教授，研究方向：生物活性物質資源。楊建明（1977-），男，副研究員，研究方向：生物催化。

國家自然科學基金（21206185，21376255）；國家高技術研究發展計劃（SS2013AA050703-2）；國家科技支撐計劃重大項目（2012BAD32B06-2）。