原料乳中高產蛋白酶嗜冷菌的分離及產酶培養基的研究

張陽旸，劉 景，陳萬義，王淵龍，任 婧，*

（1.乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司研究院，上海 200436；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

原料乳中高產蛋白酶嗜冷菌的分離及產酶培養基的研究

張陽旸1，2，劉 景1，陳萬義1，王淵龍1，任 婧1，*

（1.乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司研究院，上海 200436；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

以原料乳為對象，使用脫脂乳平板篩出三株有較強蛋白酶水解性的嗜冷菌，通過時間-酶活曲線復篩出一株高產蛋白酶的嗜冷菌Px-1。針對其產蛋白酶培養基進行了正交優化，研究了其產酶培養基的主要成分，結果表明酵母浸出粉對產酶影響顯著。通過本實驗最終確定了最佳培養基組成：蔗糖4%，α-乳糖4%，葡萄糖2%；酵母浸出粉0.7%，干酪素0.5%，胰蛋白胨0.3%以及0.05%的吐溫80。在此條件下，Px-1產蛋白酶活為42.5451U/mL，高于優化前的測定值30.2291U/mL。

原料乳，嗜冷菌，蛋白酶，培養基，優化

牛奶中的嗜冷菌幾乎覆蓋了牛奶中常見的細菌的所有類群[1-2]，由于嗜冷菌對牛乳的污染造成了大量乳制品的腐敗[3]。目前，對于牛乳中的嗜冷菌，已經有一些先進的快速檢測方法，如直接熒光過濾法、電阻抗法、PCR法、流動血細胞法及酶聯免疫吸附技術等[4-9]，但這些方法成本過高。為了解決這個問題，僅從嗜冷菌菌體本身考慮已經無法達到快速檢測的目的，因此可以從其分泌的蛋白酶入手，通過對其酶活性的檢測以及酶活和菌數之間建立的聯系達到快速檢測原料乳中嗜冷菌數的目的，此前已有研究表明，牛乳中的嗜冷菌數和蛋白酶活性存在一定的關系[10]。這為建立嗜冷菌快速檢測方法提供理論依據。

但由于原料乳中嗜冷菌分泌的蛋白酶含量很低[11]，自 然 其 活 力 也 不 高 ，因 而 限 制 了 檢 測 的 精 確度。而培養基的成分是影響嗜冷菌發酵水平的關鍵因素，因此，如何提高產酶培養基靈敏度，即如何優化產酶培養基便是本研究所要討論的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳樣 取自上海地區牧場；福林試劑、三氯乙酸、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、酪氨酸、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、脫脂奶粉、瓊脂粉、α-乳糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、大豆蛋白胨、硫酸銨、尿素、干酪素、吐溫20、吐溫60、吐溫80、SDS 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

MLS-3750高壓滅菌鍋 日本SANYO；Minispinplus臺式離心機 德國艾本得eppendorf；BPH-9082恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；SpectraMax M5酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 MPC瓊脂培養基（1000mL）：胰蛋白胨5g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，脫脂奶粉1.0g，瓊脂15g，蒸餾水，pH調節至7.0±0.1。

種子培養基（1000mL）：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水，pH調節至7.0±0.1。

脫脂乳平板（1000mL）：脫脂乳粉100g，瓊脂粉15g，pH調節至7.0±0.1。

產酶基礎培養基（1000mL）：葡萄糖20g，酵母膏10g，KH2PO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.2g，pH調節至6.5。

1.2.2 菌株篩選

1.2.2.1 初篩 將原料乳制備成不同稀釋濃度的菌懸液，選擇3個稀釋度，每個稀釋度取0.1mL涂布于脫脂乳平板，7℃條件下培養10d。將脫脂乳平板上能形成透明圈的菌落，挑出在脫脂乳平板上純化分離2～3次，分離純化出的單菌落點接于脫脂乳平板培養基上，7℃培養10d，測量并計算水解圈與菌落直徑比值HC[12]。

1.2.2.2 復篩 將初篩中透明圈直徑與菌落之比較大的菌株接種于種子培養基中，180r/min搖瓶培養10h，按5%（v/v）的接種量轉入復篩培養基中，離心5min，取上清液，利用福林-酚法測定菌株產蛋白酶的粗酶酶活[13]，通過時間-酶活曲線篩選出產酶酶活最高的菌株[14]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同碳源對產酶的影響 分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、α-乳糖、淀粉作為碳源，以酵母膏作為氮源，其他成分同產酶基礎培養基，單因素實驗選擇合適的碳源。

1.2.3.2 不同氮源對產酶的影響 選擇酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、酪蛋白作為氮源，以葡萄糖作為碳源，其他同產酶基礎培養基，單因素實驗選擇合適的氮源。

1.2.3.3 不 同 表 面 活 性 劑 對 產 酶 的 影 響 選 擇 吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80，SDS作為表面活性劑，其他同產酶基礎培養基，單因素實驗選擇合適的表面活性劑。

1.2.4 發酵培養基的正交設計 通過單因素實驗，篩選出蔗糖、α-乳糖、葡萄糖、酵母浸出粉、干酪素、胰蛋白胨、吐溫80為影響因子，在單因素實驗的基礎上，每個因子設定三個水平，正交設計出18組實驗（表1），以產蛋白酶活力為標準進行優化組合篩選。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

2.1.1 菌株初篩結果 從圖1和表2可知，實驗篩選出了9株能產生明顯的透明圈的嗜冷菌，通過比較不同的菌株在脫脂乳平板上的透明圈/菌落直徑比（HC值），可以看出，菌株Px-2，Px-4，Px-6，Px-7，Px-8，Px-9的HC值均在2.00以下；而菌株Px-1，Px-3，Px-5的HC值均在2.4以上，由此初步判定，菌株Px-1，Px-3，Px-5相對另外6株菌株具有較強的產蛋白酶能力，因此選用這三株菌進行復篩以確定其中高產蛋白酶的嗜冷菌。

表1 產酶培養基正交組合實驗設計（L1873）Table 1 Orthogonal design of enzyme producing medium（L1873）

表2 產蛋白酶嗜冷菌透明圈/菌落直徑比Table 2 Transparent circle diameter-to-colony diameter ratios of 9 bacterial isolates

2.1.2 菌株復篩 圖2為蛋白酶活力標準曲線，由圖2可以看出，在波長范圍內660nm處的吸光光度值與蛋白酶活性有良好的線性關系，檢測限量為0.995。因此可以確定，采用此法檢驗嗜冷菌產蛋白酶酶活，方法可靠。對初篩的3株菌株Px-1，Px-3，Px-5進行分離純化后，在產酶基礎培養基中搖瓶發酵48h，溫度28℃，轉速為180r/min，每6h取樣測定三株菌的產蛋白酶酶活，繪制時間-酶活曲線圖，結果見圖3。

圖1 Px-1，Px-3，Px-5產生的水解圈Fig.1 Hydrolytic ring of Px-1，Px-3，Px-5

圖2 蛋白酶活性標準曲線Fig.2 The standard curve of protease activity

圖3 Px-1，Px-3，Px-5的蛋白酶酶活-時間曲線Fig.3 The enzyme-time activity curve of Px-1，Px-3，Px-5

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，Px-1，Px-3，Px-5的產酶活性逐漸達到最高點，之后開始下降。其中Px-1在培養時間0～30h內酶活不斷增加，并在30h達到最高，為30.3488U/mL。30h后酶活開始逐漸降低；Px-3在30h酶活達到最高為24.5566U/mL；Px-5在24h酶活達到最高為7.1289U/mL。由此可以推出，發酵培養時間可能是影響酶活的重要因素，菌液接入發酵液后短時間內酶活力較低，可能是因為此時菌數不多，且大多數菌還處于生長調整期，主要進行的是菌體生長活動。而隨著發酵時間逐漸增加，菌體數也會隨之顯著增加，到達穩定期后，細菌數量保持穩定，開始分泌代謝產物，因此在這段時間內，酶活隨著發酵時間的增加逐漸增加。在穩定期后，隨著培養時間的增加，細菌開始進入衰亡期，菌體老化，生物量下降，因此培養時間過長反而出現酶活降低的情況[15]。因此本實驗通過比較三株菌在相對最佳酶活時間點處的酶活，以在30h處酶活最高的Px-1作為研究對象。

2.2 產酶培養基的優化

2.2.1 不同碳源對蛋白酶活力的影響 不同碳源對蛋白酶活力的影響如圖4所示，Px-1在5種不同碳源條件下培養時，碳源對蛋白酶的活力具有一定的影響，影響力大小依次為蔗糖＞α-乳糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞淀粉。相對其他碳源來說，蔗糖對嗜冷菌具有很好的增殖菌體作用[16]。

圖4 不同碳源對Px-1產蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on enzyme activity of protease

2.2.2 不同氮源對蛋白酶活力的影響 不同氮源對蛋白酶活力的影響如圖5所示，Px-1在5種氮源條件下培養時，氮源對蛋白酶活力的影響較為顯著，其中酵母浸出粉影響最大，酶活力達35.2767U/mL、其次分別是干酪素、胰蛋白胨、尿素和大豆蛋白胨。

圖5 不同氮源對Px-1產蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity of protease

2.2.3 不同表面活性劑對蛋白酶活力的影響 由圖6可知，表面活性劑對Px-1產酶的影響一次為吐溫80＞吐溫60＞SDS＞吐溫20。吐溫80、吐溫60顯著的提高了蛋白酶的活力，可能是因為表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的通透性，使更多的酶從細胞內透過細胞膜泄漏出來，從而有利于胞外酶的分泌，從而提高了酶的產量[17]。

2.2.4 正交實驗結果 圖7為嗜冷菌Px-1在不同培養基中的發酵產生的蛋白酶酶活曲線，對正交設計的18個配方進行發酵產酶實驗，結果表明，9號配方產蛋白酶活力最強，為42.5510U/mL。配方為蔗糖4%，α-乳糖4%，葡萄糖2%；酵母浸出粉0.7%，干酪素0.5%，胰蛋白胨0.3%以及體積分數0.05%的吐溫80。在所有的實驗組中，除了1、5、11、12、14、15、18組以外，其他配方組產蛋白酶的活力均在30.3488U/mL以上，均高于優化前Px-1在30h時的產蛋白酶酶活力。

2.2.5 正交實驗結果方差分析 各因素對Px-1產蛋白酶的影響程度可以由p值確定，利用SPSS軟件分析實驗結果[18]，得出各因素的p值，結果如表3所示。由于p值越小越顯著，結果表明，影響Px-1產酶的最顯著因素是酵母浸出粉，其p值為0.011＜0.05。其余因素對產酶影響并不顯著。

圖6 不同表面活性劑對Px-1產蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of different surfactants on enzyme activity of protease

圖7 Px-1在優化后產酶培養基中的酶活曲線Fig.7 The enzyme activity curve of Px-1 in optimized medium

表3 正交實驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

3 結論

本實驗從原料乳中篩選到三株顯著產蛋白酶嗜冷菌Px-1、Px-3、Px-5，通過時間-產酶曲線確定其中高產蛋白酶的菌株Px-1，產酶培養的最佳時間為30h，初始產酶水平為30.3488U/mL。通過單因素實驗和正交確定了最佳產蛋白酶培養基組成：蔗糖4%，α-乳糖4%，葡萄糖2%，酵母浸出粉0.7%，干酪素0.5%，胰蛋白胨0.3%以及體積分數0.05%的吐溫80；通過對正交實驗結果的方差分析可知，酵母浸出粉對Px-1產酶影響顯著，在優化后的產酶培養基中培養30h后所測得的最高蛋白酶活力高于基礎產酶培養基中培養30h后的蛋白酶活力，因而通過在優化產酶培養基上的培養，可以提高檢測的精確度。

[1]T.S?rhaug.Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products：Quality aspects[J].Trends in Food Science& Technology，1999（8）：35-41.

[2]Samagh，Cunningham.Numerical Taxonomy of the Genus Pseudomonas from Milk and Milk Products[J].Journal of Dairy Science，1971（55）：19-24.

[3]韓中惠，黃艾祥，毛華明，等.嗜冷菌對牛乳的危害及檢測控制[J]. 中國奶牛，2012（19）：42-44.

[4]Pettipher.Review：The direct epifluorescent filter technique [J].Journal of Food Technology，1986，21（5）：535-546.

[5]周向華，王銜彬，葉興乾.電阻抗法在食品微生物中快速檢測中的應用[J]. 糧油加工與食品機械，2003（10）：73-75.

[6]Gutierrez R，Garcia T，Gonzalez I.A quantitative PCR-ELISA for the rapid enumeration of bacteria in refrigerated raw milk[J]. Journal of Applied Microbiology，1997，83（4）：518-523。

[7]N Yamaguchi.H Ohba，M Nasu.Simple detection of small amounts of Pseudomonas cells in milk by using a microfluidic device[J].Letters in Applied Microbiology，2006，43（6）：631-636.

[8]R Gutiérrez，I González，T García.Monoclonal antibodies and an indirect ELISA for detection of psychrotrophic bacteria in refrigerated milk[J].Journal of Food Protection，1997，60（1）：23-7. [9]龐偉華.牛乳中嗜冷菌檢測方法的研究進展[J]. 中國乳業，2013（1）：58-60.

[10]王輝，呂加平，遲玉杰.牛乳中嗜冷菌數與胞外蛋白酶活性相關性的研究[J]. 食品工業科技，2008，29（2）：84-86.

[11]張書文，劉鷺，李紅娟，等.熒光假單胞菌胞外蛋白酶的純化及其特性研究[J]. 食品科學，2012，33（9）：206-210.

[12]龐宗文，李敏，李樹波，等.產蛋白酶毛霉的分離篩選及發酵豆粕產大豆肽的初步研究[J]. 現代食品科技，2010（9）：956-961.

[13]顧瑾麟，夏永軍，張紅發，等.開菲爾粒中高產蛋白酶菌株的篩選及培養基優化[J]. 現代食品科技，2013，29（3）：558-562.

[14]廉立慧，高麗君，王德才，等.高溫蛋白酶產生菌的篩選及其產酶條件和酶學性質分析[J]. 生物技術通報，2011（3）：175-179.

[15]任靜，宋興舜，張蘭威.原料乳中典型嗜冷菌增菌培養條件優化[J]. 中國乳品工業，2009，37（6）：13-15.

[16]劉堅真，黃珂，陳偉力.培養基對細菌總數測定的影響及其改進[J]. 食品科學，2003（6）：105-108.

[17]薛林貴，景春娥，趙旭，等.重離子誘變技術選育堿性蛋白酶高產菌株[J].微生物學通報，2010，37（6）：845-851.

[18]張秋會，李苗云，趙改名，等.牛乳酪蛋白水解特性研究[J].現代食品科技，2010，26（10）：1130-1133.

Study on screening and optimization of fermentation media of high protease-producing psychrotrophic bacteria

ZHANG Yang-chang1，2，LIU Jing1，CHEN Wan-yi1，WANG Yuan-long1，REN Jing1，*
（1.State Key Laboratory of Biotechnology Industry，Bright Dairy Research Institute，Shanghai 200436，China；2.College of Food of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Three psychrotrophic strains coded Px-1，Px-3 and Px-5 which could produce protease and have obvious hydrolysis circles on defatted milk powder plate，that were isolated from raw milk.The stains were isolated again by time-enzyme activity curve.The strain Px-1 had the strongest protease activity.Composition of fermentation medium was optimized by quadratic design.The optimum fermentation medium composition was as following：4%sucrose，4%alpha lactose，2%glucose，0.7%yeast extract powder，0.5%casein，0.3%tryptone and 0.05%tween 80.Under the optimum conditions ，the protease activity of Px-1 could reach 42.5451U/mL ，higher than the value before optimization 30.2291U/mL.

raw milk；psychrotrophic bacteria；protease；fermentation medium；optimization

TS252.1

A

1002-0306（2014）20-0204-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.036

2013－12－17

張陽旸（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學與分子生物學。

* 通訊作者：任婧（1980-），女，高級工程師，研究方向：乳酸菌分子生物學。

國家“十二五”科技支撐計劃課題（2012BAD12B08）；國家“973”計劃課題（2012CB723706）。