響應面法優化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，王 微，張志清

（四川農業大學食品學院，四川雅安 625014）

響應面法優化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，王 微，張志清*

（四川農業大學食品學院，四川雅安 625014）

以花椒籽蛋白為原料，采用胃蛋白酶水解制備抗菌肽。在單因素實驗結果的基礎上，應用Box-Behnken中心組合 方 法 進 行 四 因 素 三 水 平 的 實 驗 設 計 ，以 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）抑 菌 率 為 響 應 值 建 立 數 學 模 型 ，確 定 底 物 濃 度4.9%、酶與底物比（g/g）0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時間3h為最佳酶解條件。此條件下酶解產生的抗菌肽復合物的抑菌率可以達到60.96%。

花椒籽蛋白，胃蛋白酶，抗菌肽，響應面分析法

花椒籽，學名椒目，是花椒果皮生產中的主要副產物，其蛋白質含量豐富，脫脂后的花椒籽種仁中蛋白質含量可以高達60.34%[1]。從氨基酸組成上看，花椒籽中有17種氨基酸，總量為9.43%，其中必需氨基酸（EAA）占4.03%，種仁粗蛋白中的EAA有谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、賴氨酸及組氨酸[1-2]。經評定，花椒籽蛋白質中的氨基酸得分為58，是一種優質的蛋白質[3]。

抗菌肽（Antibacterial peptide），被認為是最有可能替代抗生素用于治療疾病的新型抗菌藥物，具有物質分子量小、活性穩定、水溶性好，還具有抗菌力強、抗菌譜廣、無污染、不易產生耐藥性等特點[4-5]。目前對于抗菌肽的研究主要以動物為主，對植物蛋白來源的抗菌肽研究還相對較少。有學者用化學法從中果咖啡、黑種草水稻、稗草、蘿卜等植物種子中分離得到了具有抗菌活性的多肽[6-9]；周世成、龔吉軍、Xiao等[10-12]分別用蛋白酶從小麥蛋白和油茶粕蛋白、麻瘋樹粕蛋白中分離得到具有抗菌活性的抗菌肽，這些發現為學者們從植物蛋白中獲取抗菌肽提供了重要的依據。花椒籽蛋白中含有較多的氨基酸，這給從花椒籽蛋白中分離出具有抗菌活性的多肽提供了可能，這對提高花椒籽的深加工水平，開發出高附加值的產品，對促進經濟發展具有重要的作用。

本研究以花椒籽蛋白抗菌肽復合物為研究對象，選取大腸桿菌為實驗菌株，旨在通過采用單因素實驗、響應面回歸分析對酶解條件進行優化，以得到產生抗菌肽的最佳酶解條件，也為分離純化其中的抗菌肽組分提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒籽蛋白 經堿處理制得（含量為259.70mg/g）；大腸桿菌（ATCC 25922） 四川農業大學食品學院微生物實驗室提供；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉 成都科龍化工試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物科技有限責任公司；胃蛋白酶1∶3000（活力1∶3000～1∶3500） 如吉生物科技有限公司；胰蛋白酶1∶250（活力≥250N.F.U/mg）、中性蛋白酶（活力＞60000U/g）、酸性蛋白酶（活力≥50U/mg） 北京華邁科生物技術有限責任公司；堿性蛋白酶（活力≥50U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；LB液體培養基 蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，調pH至7.4，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

CP225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SW-CJ型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-A型恒溫振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo ST16R冷凍離心機 美國賽默飛有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花椒籽蛋白抗菌肽的制備工藝 制備工藝參考薛培宇等的方法，并作一定的修改[13]。稱取適量花椒籽蛋白溶于一定量的去離子水中，在恒溫水浴鍋中預熱，達到反應溫度后調節溶液的pH，然后加入一定量的蛋白酶進行反應，在反應過程中不斷滴加HCl或NaOH以維持溶液的pH。反應結束后，取出放入90℃水浴滅酶15min，冷卻，然后4℃、8000r/min離心10min，取上清液，真空冷凍干燥，凍干粉保存備用。

1.2.2 抑菌活性的測定 稱取0.250g凍干粉溶于2mL去離子水中，調節樣液的pH至近中性，4℃、12000r/min離心5min，然后用0.22μm的濾膜過濾除菌后進行抑菌實驗。

抑菌率的測定參考文獻[14]。以大腸桿菌為受試菌，接種于LB液體培養基中，37℃恒溫培養24h。取過濾除菌后的樣液100μL，加LB培養基30μL和菌懸液70μL（菌懸液濃度為103～104CFU/mL）并混勻，37℃、150r/min搖床孵育1h，取100μL傾注于LB平板，37℃培養過夜，計算菌落數。以去離子水為對照組。計算抑菌率。實驗重復3次，結果取平均值。

抑菌率（%）=（對照組菌落數-實驗組菌落數）/對照組菌落數×100

1.2.3 單因素實驗設計 本研究以花椒籽蛋白對大腸桿菌的抑菌率為對照，考察胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶這5種酶分別在底物濃度2.5%、酶與底物比1∶100、酶解3h時提取出的酶解產物對大腸桿菌抑菌率大小，從中優選最佳酶進行后續的條件優化，其廠家提供的較優參考酶解條件如表1所示。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of 5 proteases

對所選酶的酶解條件，主要考察底物濃度、酶與底物比、pH、酶解溫度及酶解時間對花椒籽蛋白酶解液抑菌效果的影響。

1.2.3.1 底物濃度對抑菌活性的影響 底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，在酶與底物比1∶100、pH 2.0、酶解溫度37℃時，酶解3h時后的產物按照1.2.2的方法測定抑菌活性。

1.2.3.2 酶與底物比對抑菌活性的影響 酶與底物比分別為1∶200、1∶100、3∶200、2∶100、5∶200，在底物濃度4%、pH2.0、酶解溫度37℃時，酶解3h時后的產物按照1.2.2的方法測定抑菌活性。

1.2.3.3 pH對抑菌活性的影響 pH分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、酶解溫度37℃時，酶解3h時后的產物按照1.2.2的方法測定抑菌活性。

1.2.3.4 酶解溫度對抑菌活性的影響 酶解溫度分別為27、32、37、42、47℃，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、pH1.5時，酶解3h時后的產物按照1.2.2的方法測定抑菌活性。

1.2.3.5 酶解時間對抑菌活性的影響 酶解時間分別為2、3、4、5h，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、pH1.5、酶解溫度37℃時，產物按照1.2.2的方法測定抑菌活性。

1.2.4 響應面法實驗設計 根據單因素實驗結果，在酶解時間為3h的條件下，對底物濃度、酶與底物比、酶解pH和酶解溫度4個影響酶解產物抑菌活性的主要因素進行優化實驗。應用Box-Behnken中心組合進行四因素三水平的實驗設計，以抑菌率為響應值，采用Desigh-Expert7.0.0軟件進行統計分析。實驗因素及水平設計見表2。

表2 響應面分析因素水平表Table 2 Analytical factors and levels for RSM

1.3 數據處理

響應面分析以外的其他數據采用Excel進行顯著性分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

花椒籽蛋白及5種蛋白酶酶解花椒籽蛋白所得的酶解液對大腸桿菌的抑菌活性見圖1。由圖1可知，花椒籽蛋白對大腸桿菌的抑菌活性較弱，而5種蛋白酶的酶解產物對大腸桿菌表現出的抑菌活性都較蛋白質高。其中胃蛋白酶酶解產物的抑菌率最高，達到54.35%，不同的蛋白酶酶解時肽段位點具有一定的氨基酸序列特異性，胃蛋白酶傾向于剪切羧基端或氨基端為芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵，從而暴露出了具有抑菌活性的小分子肽段。因此，本研究選取胃蛋白酶制備抗菌肽。

圖1 花椒籽蛋白及酶的種類對抑菌活性的影響Fig.1 Effect of prickly ash seed protein enzyme type on antibacterial activity

2.2 胃蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽主要影響因素分析

2.2.1 底物濃度對抑菌活性的影響 不同底物濃度對酶解液抑菌效果的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著底物濃度的增加，酶解液的抑菌效果也逐漸增加，在底物濃度為4%時酶解液的抑菌效果達到最大，隨著底物濃度的升高，抑菌效果出現下降的趨勢，底物濃度增大導致酶解不完全，其中的抑菌組分的對應比例下降，導致抑菌效果降低。因此，最佳底物濃度為4%，優化實驗底物濃度選擇范圍為3%～5%。

圖2 底物濃度對抑菌活性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on antibacterial activity

2.2.2 酶與底物比對抑菌活性的影響 不同酶與底物比對酶解液抑菌效果的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著酶添加量的增加，酶解產物的抑菌活性呈現先增加后降低的趨勢。在酶與底物比為1∶100時，酶解液的抑菌效果是最高的。當酶濃度過高時，底物濃度相對較低，酶與底物沒有完全結合，當酶用量足夠高時，過量的酶會加快多肽水解成更小的分子片段，導致抑菌活性降低。因此，最佳酶與底物比為1∶100，優化實驗酶與底物比選擇范圍為1∶200～3∶200。

2.2.3 pH對抑菌活性的影響 不同pH對酶解液抑菌效果的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著pH的增大，花椒籽蛋白酶解液對大腸桿菌的抑制作用呈現先增大后減小的趨勢。pH在1.5時，酶解液的抑菌活性達到最大。pH低于或高于1.5都可能對胃蛋白酶的結構造成影響，導致酶的活性降低，從而使酶解液的抑菌活性受到影響。因此，最佳pH為1.5，優化實驗pH選擇范圍用1.0～2.0。

2.2.4 酶解溫度對抑菌活性的影響 不同溫度對酶解液抑菌效果的影響結果見圖5。由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液對大腸桿菌的抑制作用是先增大后減小的，在溫度為37℃時酶解液的抑菌效果達到最高。如果反應溫度過低，會降低酶與底物的碰撞幾率；但溫度過高時，就會導致蛋白酶喪失或部分喪失催化活性，不利于酶解反應進行，導致酶解液的抑菌效果下降。因此，最佳酶解溫度為37℃，優化實驗酶解溫度選擇范圍32～42℃。

圖3 酶與底物比對抑菌活性的影響Fig.3 Effect of enzyme/substrate ratio on antibacterial activity

圖4 pH對抑菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on antibacterial activity

圖5 酶解溫度對抑菌活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on antibacterial activity

2.2.5 酶解時間對抑菌活性的影響 不同酶解時間對酶解液抑菌效果的影響結果見圖6。由圖6可知，花椒籽蛋白酶解液對大腸桿菌的抑菌效果隨著酶解時間的延長呈現先增加后減小的趨勢，在酶解時間為3h時達到最大。酶解時間太短時，具有抑菌活性的殘基不能暴露出來，顯示不出抑菌活性，而反應時間延長，則會導致肽的結構受損，趨向于將肽段酶解為小分子的短肽，使抑菌活性會有所降低，但變化不大；同時隨酶解時間增加，底物產量增加也會抑制酶解反應的進行。因此，最佳酶解時間為3h，優化實驗中的酶解時間定為3h。

圖6 酶解時間對抑菌活性的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on antibacterial activity

通過上述單因素實驗結果分析，底物濃度、酶與底物比、pH、酶解溫度和酶解時間這5個因素對花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌活性影響均顯著。單因素實驗所確定的胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的合適條件為：底物濃度4%，酶與底物比1∶100，pH1.5，酶解溫度37℃，酶解時間3h，此實驗結果為設定響應面實驗因素水平的零點提供參考。

2.3 響應面法優化胃蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽

2.3.1 響應面法實驗設計及制備的抗菌肽抑菌效果

響應面分析方案及實驗結果和方差分析見表3和表4。

由表4可以看出，回歸模型是顯著的（p＜0.0001）。模型的R2=98.72%，表明有98.72%的抑菌率變化可由該模型解釋。模型失擬項的p檢驗值為0.7925（p＞0.05），這說明使用該模型可以充分解釋響應中的變異，模型的擬合效果良好，實驗誤差小，因此，該回歸模型可以用來對花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌活性進行分析和預測。

在該模型中，回歸系數顯著性檢驗顯示，一次項X1、X2、X3，平方項X12、X22、X42，交互項X1X2、X1X4、X2X3、X2X4的影響均達到極顯著水平；平方項X32，交互項X3X4的影響達到顯著水平。由方差分析可知，研究范圍內的4個因素對花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌率大小順序為：底物濃度＞酶與底物比＞pH＞酶解溫度。

綜合上述分析結果，剔除模型中不顯著的項，得到花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌率預測的二次多元回歸模型為：

表3 響應面分析實驗設計及結果Table 3 Experimental design and results for MSR

2.3.2 因素間的交互作用 用Desigh-Expert軟件對4因素間的交互作用進行全面的模型分析，并對交互作用影響顯著的兩因素繪制響應面曲線圖。

圖7 底物濃度和酶與底物比對花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應曲面圖Fig.7 3-D surface plot for effect of substrate concentration vs. enzyme/substrate ratio on inhibitory rate to E.coli

由圖7可見，隨著底物濃度和酶與底物比的增加，酶解液的抑菌活性都呈現先增大后降低的趨勢。當酶與底物比過大時，較少的底物能與蛋白酶完全結合，隨著底物濃度的增大，酶解液的抑菌活性增強；當底物濃度過大時，酶在反應體系中的濃度相對較低，蛋白酶更易解離為單體，常比多聚體更易失活[15]，從而使酶解液的抑菌活性降低。

表4 方差分析結果Table 4 Results of analysis of variance

圖8 底物濃度和酶解溫度對花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應曲面圖Fig.8 3-D surface plot for effect of substrate concentration vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

由圖8可見，當酶解溫度一定時，隨著底物濃度的增加，酶解液的抑菌活性呈現先增大后減小的趨勢。當底物濃度處于低水平時，酶解物的抑菌活性隨著溫度的升高而增大，后趨于平緩；當底物濃度處于高水平時，酶解物的抑菌活性隨著酶解溫度的升高而逐漸降低。

圖9 酶與底物比和pH值對花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應曲面圖Fig.9 3-D surface plot for effect of enzyme/substrate ratio vs. pH value on inhibitory rate to E.coli

由圖9可知，無論pH處于何種水平，隨著酶與底物比的增大，酶解液的抑菌活性呈現先增大后降低的趨勢。在酶與底物比低水平時，酶解液的抑菌活性隨pH的變化較小；在酶與底物比高水平時，酶解液的抑菌活性隨著pH的增加而逐漸增大。

由圖10可見，無論酶解溫度處于何種水平，酶解物的抑菌活性隨著酶與底物比的增大呈現先增加后降低的趨勢。當酶與底物比處于低水平時，酶解物的抑菌活性隨著酶解溫度的升高呈現緩慢的上升趨勢；當酶與底物比處于高水平時，酶解物的抑菌活性隨酶解溫度的升高而緩慢降低，在0水平值以后，抑菌活性降低速度加快，這可能是溫度升高，造成蛋白酶的構象變化，蛋白酶出現部分失活或變性，導致酶解液對大腸桿菌的抑菌活性降低。

由圖11可見，無論酶解溫度處于何種水平，隨著pH的增加，酶解液的抑菌活性明顯增加。當pH處于低水平時，酶解液的抑菌活性隨著溫度的升高呈現先增大后降低的趨勢；當pH處于高水平時，隨著酶解溫度的升高，酶解液的抑菌活性變化不明顯，在溫度為0水平值左右時，抑菌活性出現明顯的下降趨勢。2.3.3 擬合優化的驗證 通過響應面的數字最優組合分析可得到胃蛋白酶水解花椒籽蛋白的最佳酶解條件為：底物濃度4.91%、酶與底物比0.88∶100、pH2.00、酶解溫度32.00℃、酶解時間3h，在此優化條件下，酶解產物對大腸桿菌抑菌率的理論值為61.83%。結合實際條件，最終選擇實驗條件為底物濃度4.9%、酶與底物比0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時間3h，實際測得酶解產物的抑菌率達到60.96%，與理論值61.83%相比，相對誤差為1.40%，說明采用響應面法優化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的酶解工藝參數準確可靠，本實驗建立的模型在實際應用中是可行的。

圖10 酶與底物比和酶解溫度對花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應曲面圖Fig.10 3-D surface plot for effect of enzyme/substrate ratio vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

圖11 pH和酶解溫度對花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應曲面圖Fig.11 3-D surface plot for effect of pH value vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

3 結論

本研究結果以大腸桿菌為指示菌，采用Box-Behnken響應面的設計原理得到了胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的最佳工藝條件為：底物濃度4.9%、酶與底物比0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時間3h，在此條件下獲得的酶解產物對大腸桿菌的抑菌率為60.96%。驗證結果表明，該模型準確可靠，具有很好的預測能力。

在本研究中，用胃蛋白酶制備花椒籽蛋白所得抗菌肽復合物對大腸桿菌的抑菌率不是很高，后續工作應對酶解產物進行進一步地分離純化，在能提高抗菌肽抑菌活性的同時，也為花椒籽蛋白抗菌肽應用到食品、醫藥等領域提供一定參考。同時胃蛋白酶制備的花椒籽蛋白抗菌肽對大腸桿菌有抑菌活性，但其抑菌機理尚未清楚，還有待進一步研究。

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Optimization of antibacterial peptides preparation using pepsin from prickly ash seed protein by response surface methodology

JIANG Tai-ling，WU Hong-yang，WANG Wei，ZHANG Zhi-qing*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

Prickly ash seed protein was hydrolyzed by pepsin for antibacterial peptides preparation.Onefactor-at-a-time method and response surface analysis based on Box-Behnken design，using four factors and three levels of response surface methodology to analyzed each factor.The inhibitory rate on Escherichia coli in response to the value of establishing mathematical model and the optimal hydrolysis condition was substrate concentration 4.9% ，enzyme/substrate ratio （g/g ） 0.9 ∶100 ，pH2.0 ，hydrolysis temperature 32℃ and hydrolysis time 3h.Under these conditions ， the obtained hydrolysate showed an inhibitory rate as high as 60.96%.

prickly ash seed protein；pepsin；antibacterial peptide；response surface analysis

TS201.2

A

1002-0306（2014）20-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.041

2014－02－12

姜太玲（1989-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

* 通訊作者：張志清（1976-），男，博士，教授，研究方向：糧油副產物開發利用。