超聲提取樺黃多糖工藝及其多糖抗氧化性能研究

趙 鵬，安葉娟，宋 逍，張婷婷，王昌利

（陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽 712046）

超聲提取樺黃多糖工藝及其多糖抗氧化性能研究

趙 鵬，安葉娟，宋 逍，張婷婷，王昌利

（陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽 712046）

目的：優化樺黃多糖的超聲提取工藝條件并初步探討其抗氧化性能。方法：在單因素實驗基礎上，以樺黃多糖提取率為評價指標，通過響應面分析方法確定樺黃多糖最佳超聲提取工藝條件；通過清除超氧陰離子自由基和DPPH自由基的實驗來檢測多糖抗氧化性能。結果：樺黃多糖最佳超聲提取工藝條件為：溫度為62℃，超聲功率為220W，時間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此優化條件下多糖的平均提取率為7.87%，得到的樺黃多糖具有較好的抗氧化性能。結論：首次得到了一條適用于樺黃多糖超聲提取的工藝路線，與傳統工藝比較，超聲提取法具有提取快、提取率高的優點。

樺黃，多糖，響應面優化法，超聲提取，抗氧化性

樺黃是多孔菌科滴孔菌屬植物樺滴孔菌（Piptoporus betulinus Karst）的 子 實 體[1]，其 主 要 生 長在海拔2300m以上發生病害的樺樹樹皮上，是陜西省民間習用藥材，具有消積、化疲、抗癌等功效，主要用于治療食管癌，胃癌，子宮癌等癥。藥理實驗發現，樺黃中的多糖成分具有較好的抗腫瘤活性，揭示多糖可能就是樺黃能夠治療腫瘤疾病中的主要活性成分，其在保健食品和醫藥應用等方面具有很好的開發應用價值。但目前對于樺黃多糖的研究主要集中在藥理實驗方面[2-3]，對其提取、純化工藝的研究較少。為了更好地開發和利用這一藥用資源，本研究對樺黃多糖的提取工藝進行了研究，由于超聲提取法具有提取時間短、效率高等優點，現在已經成為提取領域研究的熱點之一[5-6]。鑒于此本研究利用響應面法優化了超聲法輔助提取樺黃多糖的工藝條件，并初步測試了其抗氧化活性，研究取得了一定的成果，為更好地利用這一藥用資源提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺黃 購自西安市萬壽路中藥材批發市場，經陜西中醫學院藥學院宋逍副教授鑒定為多孔菌科滴孔菌屬植物樺滴孔菌（Piptoporus betulinus Karst）的子實體；葡萄糖、無水乙醇、濃H2SO4、苯酚 均為分析純。

KQ-400DB型數控型超聲清洗器 江蘇昆山超聲有限公司；電子天平 梅特勒-托利多有限責任公司，精度：0.001g；EYELA型旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺黃多糖超聲提取工藝路線 先將干燥的樺黃粉碎，過60目篩，用無水乙醇進行脫脂，然后將脫脂后的藥材顆粒置于圓底燒瓶中，并按設計的料液比加入蒸餾水，在超聲輔助的條件下進行提取，提取完成后，提取液抽濾后，按原藥材質量1∶1（g/mL）濃縮，加入一定量的無水乙醇，于冰箱中靜置過夜，抽濾，濾餅依次用無水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，得疏松粉末后，真空干燥，即得樺黃粗多糖。

1.2.2 樺黃多糖含量與提取率測定 多糖含量的測定按照文獻[7]報道的苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對照品，繪制標準曲線為：A=0.0103C+0.0004，相關系數r= 0.9991，濃度范圍在0～50μg/mL，線性良好。

多糖提取率的計算用下式：

1.2.3 樺黃多糖提取單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），提取時間25min，超聲功率120W，提取2次，分別考察不同提取溫度（40、50、60、70、80℃）對樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.2 超聲功率對多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），提取時間25min，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同超聲功率（120、160、200、240、280W）對樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.3 提取時間對多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），超聲功率200W，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同提取時間（25、30、35、40、45min）對樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.4 液料比對多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份超聲功率200W，提取時間35min，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g））對樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.5 提取次數對多糖提取率的影響 精確稱取50g的干燥樺黃，每份液料比為14∶1（mL/g），超聲功率200W，提取溫度60℃，提取時間25min，考察不同提取次數（1、2、3、4次）對樺黃多糖提取率的影響。

1.2.4 樺黃多糖超聲提取工藝條件優化實驗 利用Box-Behnken響應面法，對樺黃多糖的超聲提取工藝進行優化，選擇對多糖提取率影響較大的因素，超聲功率、提取溫度、時間及液料比進行研究，提取次數均定為2次，確定樺黃多糖的最優超聲提取工藝條件。實驗因素和水平設計如表1所示。

1.2.5 樺黃多糖熱水浸提工藝 為了對比超聲提取工藝的優劣性，本研究在液料比10∶1（mL/g），提取溫度為80℃，提取時間為120min的條件下，對樺黃進行了熱水浸提法提取。

1.2.6 抗氧化性能測試 參照文獻[7]測試樣品對超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除效果。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the designed experiment

2 結果與討論

2.1 單因素實驗各個因子對提取率的影響

2.1.1 提取溫度對多糖提取率的影響 從圖1可以看出，當提取溫度在60～70℃時，多糖的提取率達到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為60℃左右。

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on extraction ratio

2.1.2 超聲功率對多糖提取率的影響 從圖2可以看出，多糖的提取率隨著超聲功率的增加先是快速增大，當超聲功率達到200W時，多糖的提取率達到最高值，其后多糖提取率呈逐步下降趨勢，因此確定多糖的提取功率為200W左右。

圖2 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasound power on extraction ratio

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響 從圖3可以看出，當提取溫度在35～40min時，多糖的提取率達到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為35min左右。

2.1.4 液料比對多糖提取率的影響 從圖4可以看出，當液料比在14∶1～18∶1（mL/g）時，多糖的提取率達到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為14∶1（mL/g）左右。

2.1.5 提取次數對多糖提取率的影響 從圖5可以看出，當提取次數為2次時，多糖的提取率達到最高值，其后多糖提取率幾乎不再改變，因此確定多糖的提取次數為2次。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction ratio

圖4 液料比對多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction ratio of water to material on extraction ratio

圖5 提取次數對多糖提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction ratio

2.2 響應面優化實驗結果與多糖提取率預測方程

按照表1的設計方案，利用Design-Expert v7.1.3軟件進行響應面法優化實驗，總計有27組實驗方案組合，其中的24組是析因實驗，3組是中心點實驗，用來評估整個優化實驗出現的誤差。

采用Design-Expert 7.01軟件對響應面優化實驗得到的結果進行研究，研究結果見表2，按照各因素對實驗結果的影響進行二次方程擬合，擬合得到下式：

表2 響應面優化實驗設計方案與結果Table 2 Program and test results of RSM

由方差分析表3的分析結果可以看出，回歸方程的F值為10.12，其顯著水平遠遠低于0.05，這說明，利用響應面法擬合得到的實驗模型顯著型極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關系數后發現，r=5.04/5.05=0.998，這一點表明用該數學模型來評估各相關因素對樺黃多糖的提取率的影響比較真實可靠。由F值可知，響應面實驗組合的各單因素中，對樺黃多糖提取率影響最大的是超聲功率，其次為溫度、液料比，提取時間的影響最小且為不顯著影響因素。

2.3 響應面圖分析

從表3的分析結果可知，六組提取因素的交互影響中，僅提取溫度與時間之間的交互影響顯著，因此對這組交互影響顯著的響應面圖進行了分析。

從圖6可以直觀的看出，在提取時間較短時升高提取溫度，或在提取溫度較低時延長提取時間（D）均可提高樺黃多糖的提取率；但提取時間較長時，升高提取溫度，多糖的提取率又呈下降趨勢，這可能是因為較高溫度下，提取時間過長，引起的多糖水解造成的。

通過響應面法預測得到的回歸模型分析[8]，可得到按照回歸模型預測的超聲提取法提取樺黃多糖的最優工藝條件是：溫度為62℃，超聲功率為215.6W，時間為34.65min，液料比為16.08∶1（mL/g），提取次數為2次，在此工藝條件下，預測提取得到樺黃多糖提取率為7.90%。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

圖6 提取溫度與時間對多糖提取率的交互影響Fig.6 Effects of time and ratio of water to material on the extraction

2.4 驗證實驗

根據預測的實驗結果，并從實際工藝操作方便考慮，微調提取的最佳工藝條件為：溫度為62℃，超聲功率為220W，時間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此工藝條件下重復操作三次，同時為了對比超聲提取法和熱水浸提法的優劣，也對樺黃多糖采用熱水浸提法進行了三次平行實驗，結果如表4所示。

從表4可看出，超聲條件下樺黃多糖的平均提取率為7.87%，實驗值與預測值基本相符，由此可知，通過響應面法預測得到的方程與實際結果高度一致，具有很高的可信性。與熱水浸提法相比，采用超聲提取法，多糖的提取時間大幅度縮短，提取率有了較大程度的提高。

表4 實驗結果Table 4 Results of the experiment

2.5 抗氧化性能分析

2.5.1 樺黃多糖對超氧陰離子自由基的清除作用 本實驗分別考察熱水浸提法、超聲提取法得到的樺黃多糖清除超氧陰離子自由基的效果，結果如圖7所示。

由圖7可看出，超聲提取法得到的樺黃多糖對超氧陰離子的清除效果強于熱水浸提法得到的樺黃多糖，并且隨著濃度的增大而逐漸增大，呈現較好的量效關系，其最大清除率達88.31%。

2.5.2 樺黃多糖對DPPH自由基的清除作用 本實驗分別考察熱水浸提法、超聲提取法得到的樺黃多糖清除DPPH自由基的效果，結果如圖8所示。

圖8 DPPH自由基清除作用Fig.8 The savenging of DPPH radical

由圖8可看出，超聲提取法得到的樺黃多糖對DPPH·的清除作用的清除效果同樣強于熱水浸提法得到的樺黃多糖，并且隨著濃度的增大而逐漸增大，呈現較好的量效關系，其最大清除率達98.2%。

3 結論

本研究首次利用Box-Behnken響應面法對樺黃多糖的超聲提取工藝進行了優化研究，最終得到了和實驗結果擬和程度較高的數學模型和較優的樺黃多糖超聲提取工藝條件：溫度為62℃，超聲功率為220W，時間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此工藝條件下重復操作三次，樺黃多糖的平均提取率為7.87%。

研究同時比較了超聲提取法得到的樺黃多糖和熱水浸提法得到的樺黃多糖的抗氧化性能，由實驗結果可知，這兩種樺黃多糖均具有較好的抗氧化活性，而超聲提取法得到的多糖其抗氧化能力較強，出現這一原因的可能是因為超聲對多糖的結構產生了一定的影響，對于其現象產生的原因，還在進一步研究之中。

結果表明，超聲提取法與熱水浸提法相比，具有提取時間短，提取溫度低，多糖提取率高的優點，本研究結果為樺黃多糖提取工藝的進一步深入研究提供一定的參考價值。

[1]趙繼鼎，徐連旺，張小青.中國多孔菌科分類系統的研究，[J]. 微生物學報，1982，22（3）：218-232.

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Study on ultrasonic wave extraction and antioxidant of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst

ZHAO Peng，AN Ye-juan，SONG Xiao，ZHANG Ting-ting，WANG Chang-li
（School of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China）

Objective：To select the optimum extracting with the assistance of ultrasonic method of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst.Methods：The response surface analysis was employed to determine the optimum technological condition.Results ： The optimum extraction conditions were as follows ： extraction temperature 62℃ ，ultrasonic power 220W，extraction time 35min，ratio of water to raw material 16 ∶1mL/g and 2 times.The yield of polysaccharides was 7.87%based on the above conditions.Conclusion：This method was suitable for the ultrasonic extraction and determination of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst. Compared with the traditional methods，ultrasonic extraction method was time-saving and efficiency.

Piptoporus betulinus Karst；polysaccharides；response surface methodology；ultrasonic extraction extraction；antioxidant

TS201.2

B

1002-0306（2014）20-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.047

2013－12－23

趙鵬（1977-），男，博士，副教授，研究方向：天然藥用活性成分分離純化。

陜西省教育廳專項（11JK0691）資助項目；陜西省中藥制藥重點學科專項基金。