黑木耳多糖的酰基化工藝研究

張 智，劉東敏，+，胡俊飛，王振宇，于 震

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150090）

黑木耳多糖的酰基化工藝研究

張 智1，劉東敏1，+，胡俊飛1，王振宇2，*，于 震1

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150090）

采用響應面法優化黑木耳多糖酰基化工藝，并考察多糖轉化后的體外抗凝血作用。結果表明：采用對羥基苯甲酸作為最佳供體，酰基化的最佳工藝條件是轉化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，并在此條件下所測的轉化率為27.26%。轉化后的多糖抗凝血性能提高。

黑木耳多糖，酰基化，響應面，抗凝血

多糖的衍生化是指通過物理、化學、生物等方法對多糖分子進行結構改造，期望改變或者產生新的生物學功能。本實驗采用化學的方法對多糖進行結構改造，修飾后的多糖抗凝血功能大大提高，一般來講，修飾后的酰基化的多糖溶解度增加，有利于其活性的發揮[1]。

血栓栓塞性疾病嚴重威脅著人類健康，目前應用于臨床治療的抗凝血藥物主要是肝素和香豆素類藥物，有誘發血小板癥等副作用，開發具有抗凝血作用的非肝素類藥物及保健食品有著重要的意義。黑木耳又稱云耳、黑菜，是一種質優的膠質食用菌和藥用菌。黑木耳多糖具有抗衰老、抗血栓、預防高血脂、高血壓、冠心病等作用[2-4]。因而，探索黑木耳多糖對人體血液系統的影響具有重要的意義[5]。本實驗的前期對黑木耳多糖提取、純化及分級并在此基礎上對多糖進行酰基化，獲得修飾后的多糖在進行體外抗凝血實驗，為把黑木耳多糖及其衍生物進一步開發成為功能性食品添加劑或者藥品提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北產黑木耳 將其粉碎過40目篩，脫脂烘干后待用；葡萄糖、石油醚、丙酮、乙醚、等試劑 均為國產分析純；凝血酶時間測定試劑盒、凝血酶原時間測定試劑盒、活化部分凝血活酶時間測定試劑盒 均購自上海太陽生物技術有限公司；動物 新西蘭白兔，體重2～3kg。

722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司制造；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；TDL-5-W臺式低速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 黑木耳粗多糖的提取純化工藝流程

原料預處理→90℃水浴浸提2h（1∶70），復提1次→4000r/min離心10min，取上清液→50℃減壓濃縮→除蛋白（Sevage法3次脫蛋白）→95%乙醇醇沉→離心取沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀→50℃烘干，得粗多糖（CAAP），復溶→自來水透析24h→蒸餾水透析24h→50℃烘干→精制多糖（AAP）[6]。

1.3 黑木耳粗多糖的得率、純度計算

按照樊黎生[7]文獻中的方法計算多糖得率及多糖純度：

黑木耳粗多糖得率（%）=（CAAP重（g）/子實體粉粒重（g））×100

精 制 多 糖（AAP）的 純 度（%）=（AAP 多 糖 含 量（mg）/AAP重（mg））×100

1.4 黑木耳多糖的分級純化

1.4.1 酸性多糖的制備 按照李公斌[8]文獻中的方法制備酸性多糖。

1.4.2 多糖分級 用水復溶酸性多糖，然后加乙醇至終濃度40%沉淀得AAP1，上清液加乙醇至終濃度60%得到沉淀AAP2，再將上清液旋轉蒸發烘干得到AAP3。

1.5 木耳多糖的衍生化實驗

1.5.1 木耳多糖轉化率的測定 將多糖制成溶液，采用NaOH滴定方法，用酚酞做指示劑，根據以下公式計算出轉化率：

式中，m0—反應初始加入的供體，mg；c—NaOH的濃度，mol/L；ΔV—多糖加入酸后的消耗的與轉化后最終滴定消耗的NaOH體積之差，mL；M—供體的分子量；n—供體游離的H+個數。

1.5.2 木耳多糖的衍生化 將濃度為5mg/mL具有較好抗凝血效果的黑木耳多糖樣品與供體按照一定的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，水浴加熱一定時間后，NaOH滴定，計算轉化率。合成后的產品在透析袋用中流動的水透析3d。最后濃縮、醇沉、并冷凍干燥后得衍生化的木耳多糖[9]。

1.5.3 供體基團的選擇 將濃度為5mg/mL黑木耳多糖樣品分別與供體L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸、對羥基苯甲酸等按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進行反應，NaOH滴定，計算轉化率，選擇最佳供體基團。

1.5.4 單因素最佳轉化條件的實驗 分別以底物與供體比例、轉化溫度、轉化時間、多糖濃度四因素進行單因素實驗，按照1.5.2中的操作，以各個因素為橫坐標，轉化率為縱坐標，繪制曲線。

1.5.4.1 最佳多糖濃度 將濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進行反應，NaOH滴定，計算轉化率，選擇最佳底物濃度。

1.5.4.2 最 佳 底 物 與 供 體 比 例 將 濃 度 分 別 為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體分別按照1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進行反應，NaOH滴定，計算轉化率，選擇最佳的底物與供體比例。

1.5.4.3 最佳轉化溫度 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，分別在40、45、50、55、60、65℃水浴6h進行反應，NaOH滴定，計算轉化率，選擇最佳轉化溫度。

1.5.4.4 最佳轉化時間 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，55℃分別水浴2、3、4、5、6、7h進行反應，NaOH滴定，計算轉化率，選擇最佳轉化時間。

1.5.5 最佳轉化條件實驗 根據單因素實驗結果為基礎，并選取上述多糖濃度、底物與供體比例、轉化溫度3個因素通過Design-expert 8.05軟件利用Box-Benhnken中心組合方法設計三因素三水平的響應面優化實驗，并據此建立數學回歸模型，做響應面分析。響應面優化因素水平設計表如表1所示。

表1 響應面因素與水平Table 1 The coding table of factor and level

1.5.6 木耳多糖的紅外光譜分析 木耳多糖及其化學修飾產物經溴化鉀壓片后，進行紅外光譜分析。

1.6 體外抗凝血

1.6.1 抗凝血實驗 新西蘭兔正常喂養，從脖子動脈取血：將全血置于含有檸檬酸鈉抗凝液（1份抗凝液+9份全血）的塑料管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心15min，取上清液，即待測血漿。取按照試劑盒說明，采用手工方法測定活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血漿凝血酶原時間（prothromtin time，PT）、血漿凝血酶時間（thromtin time，TT）[10]。

1.6.2 三種級分的木耳多糖抗凝血對比 將AAP1、AAP2和AAP3配成0.5mg/mL的溶液，按照1.6.1方法進行體外抗凝血實驗，并將具有較好的抗凝血效果的級分作為下面微生物轉化的原料。

1.6.3 酰基化多糖的抗凝血實驗 將未轉化的多糖和轉化的多糖進行抗凝血實驗，觀察酰基化后的黑木耳多糖的抗凝血效果。

1.6.4 數 據 分 析 本 實 驗 數 據 統 計 采 用SPSS 17.0分析軟件對黑木耳多糖抗凝血作用進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s檢驗。

2 結果與分析

2.1 木耳多糖的提取與純化

木耳多糖經醇沉烘干后得到粗多糖（CAAP），得率為7.89%，低于文獻報道中得率，估計是提取次數太少以及Sevage法3次除蛋白過程中損失的多糖較大。透析完后獲得的精制多糖（AAP）純度為81.3%。

2.2 酸性多糖的制備及分級

將1.0%精制多糖（AAP）分成酸性多糖、中性多糖，兩種多糖分別占66.08%、33.93%，本文的數據與李公斌[8]的數據相差較大，主要原因是在獲得酸性多糖沉底后，要經過解離和透析，中間過程造成多糖損失較大，因此造成酸性多糖所占比例降低。然后將酸性多糖按照1.4.2進行分級得到AAP1、AAP2、AAP3三種多糖，分別占33.55%、23.48%、42.97%。

2.3 木耳多糖的衍生化實驗

2.3.1 供體基團的選擇 將具有較好抗凝血效果的AAP3與供體按5∶1的比例混合，50℃反應6h后得到結果見圖1。由圖1可以看出，加入對羥基苯甲酸獲得的轉化率最高，多糖轉化程度最高，其次是L-半胱氨酸，L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸轉化率在15%以內，結果表明對羥基苯甲酸可以提高多糖的轉化率。

圖1 各種酸類的比較Fig.1 Compare with several acid

2.3.2 多糖轉化的單因素實驗

2.3.2.1 多糖濃度對轉化率的影響 圖2反映了多糖濃度對轉化率的影響情況。隨著多糖濃度的增加，轉化率在1.0mg/mL之前增加，之后再呈下降趨勢，原因可能是木耳粘多糖的粘度增加導致供體酸不能充分接觸，轉化率降低。

圖2 多糖濃度對轉化率的影響Fig.2 Effect of polysaccharide concentration on conversion rate

2.3.2.2 底物與供體比例對轉化率的影響 圖3反映了底物與供體比例對轉化率的影響，隨著比例的增加在底物與供體比例為10∶1處，轉化率先增加后減小。可能是在供體一定的情況下，隨著多糖的增加供體能夠充分和多糖反應，但多糖的粘度也隨之增加，導致當粘度增加到某點時，供體與多糖不能充分接觸，導致轉化率降低。

圖3 底物與供體比例對轉化率的影響Fig.3 Effect of the ratio of polysaccharide to acyl donor on conversion rate

2.3.2.3 轉化溫度對轉化率的影響 圖4反映了轉化溫度對轉化率的影響，隨著溫度的升高轉化率先升高后降低，轉化溫度在55℃時，轉化率達到最高值。溫度升高可以降低多糖的粘度，轉化率升高，但是溫度太高會發生副反應，導致轉化率降低，故選擇最佳轉化溫度為55℃。

圖4 轉化溫度對轉化率的影響Fig.4 Effect of conversion temperature on conversion rate

2.3.2.4 轉化時間對轉化率的影響 圖5顯示了轉化時間對轉化率的影響。隨著轉化時間的增長轉化率一直呈上升趨勢，在轉化時間為4.0h處轉化率增長趨于平緩，這說明到轉化時間為4.0h時，轉化基本結束，綜合經濟成本的考慮，選擇最佳的轉化時間為4.0h。

圖5 轉化時間對轉化率的影響Fig.5 Effect of conversion time on conversion rate

2.3.3 響應面法優化最佳轉化條件

2.3.3.1 響應面實驗方案與結果 依據單因素實驗結果利用Box-Benhnken中心組合方法設計響應面實驗方案，以轉化率為響應值，實驗設計如表2所示。根據 Box-Behnken 法 擬 合 出 的 回 歸 方 程 ：Y=26.90 －0.23A＋1.15B－0.84C－3.80A2－8.29B2－0.47C2－0.16AB＋0.25AC－0.11BC。

表2 響應面實驗方案及結果Table 2 Experiment design and estimated values of response surface

2.3.3.2 響應面實驗方差分析 對上述模型方程進行方差分析，各因素的方差分析結果如表3所示。由該表數據可知，此模型是顯著的（p＜0.0001）。失擬性值其Prob＞F值為0.2520（p＞0.05），說明該模型的擬合度較好。

底物與供體比例的影響最大，其Prob＞F值為小于0.0001，達到了極顯著水平；轉化溫度影響較小，但其Prob＞F值為0.0428 （p＜0.05），也達到了顯著水平。各因素對結果的影響按大小排序依次為B（底物與供體比例）、C（多糖濃度）和A（轉化溫度）。

由表3可知，各因素之間的交互作用對轉化率的影響不大。A2、B2酰基化工藝影響很大，其Prob＞F值均小于0.0001，達到了極顯著水平，C2也對酰基化工藝影響很大，Prob＞F值為0.0075，達到了顯著水平。

圖6～圖8直觀地反映了各因素之間的交互作用及其對響應值的影響。按照回歸模型預測的多糖衍生化的最佳工藝條件為：轉化溫度54.69℃，底物與供體比例10.38∶1，多糖濃度0.54mg/mL，在此條件下，多糖衍生化轉化率理論上可達到27.33%。根據實踐操作的可行性考慮，校正最佳工藝條件為：轉化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of factors of response surface

圖6 轉化溫度和底物與供體比例對轉化率影響的響應面圖Fig.6 Response surface graph of conversion temperature and the ratio of polysaccharide to acyl donor to the conversion rate

圖7 轉化溫度和多糖濃度對轉化率工藝影響的響應面圖Fig.7 Response surface graph of conversion temperature and polysaccharide concentration to the conversion rate

2.3.3.3 驗 證 實 驗 根 據 上 述 優 化 結 果 ，轉 化 溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，轉化時間4h的優化工藝條件下，重復實驗3次，測得多糖轉化率分別為27.29%、27.26%、27.24%，平均值為27.26%。驗證結果與響應面實驗預測的結果27.27%沒有顯著性差異，說明預測方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性。

圖8 多糖濃度和底物與供體比例對轉化率影響的響應面圖Fig.8 Response surface graph of the ratio of Polysaccharide to acyl donor and polysaccharide concentration to the conversion rate

2.3.4 酰基化木耳多糖的紅外光譜 將酰化的產物與未酰化的多糖樣品在分辨率為4cm-1的Avatar型紅外譜儀上進行紅外檢測，波數400～4000cm-1，掃描32次。譜圖如圖9及圖10所示。

圖9 未酰基化多糖的紅外掃描圖譜Fig.9 IR analysis of polysaccharide without the derivatization

圖10 酰基化多糖的紅外掃描圖譜Fig.10 IR analysis of polysaccharide by the derivatization

圖9和圖10圖譜中均在3400cm-1附近出現強的-O-H鍵的伸縮振動吸收特征峰，說明多糖鏈上的羥基未完全被酰基所取代，同時可以看出酰基化多糖在3430.27cm-1處的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酰基化。另外，在2900cm-1附近的峰為多糖單 元 上-CH2-不 對 稱 振 動 吸 收 。 圖10中1551.12、1462.45、1455.36cm-1可能是芳烴骨架C=C鍵伸縮振動吸收峰，而圖9中未出現，說明未酰化的多糖已經連接上了對羥基苯甲酸，同時在1746.33cm-1處有一吸收峰為多糖酰基化后C=O鍵的吸收峰，以上充分說明多糖酰基化成功。

2.4 體外抗凝血實驗

2.4.1 分級多糖（AAP1、AAP2、AAP3）體外抗凝血功能對比 將多糖配成0.5mg/mL濃度的溶液，按照試劑盒說明書操作，對多糖進行PT、APTT和TT實驗，如表4所示。從表4中數據可看出多糖級分AAP1、AAP2、AAP3抗凝血作用逐漸增加，所以選擇具有抗凝血作用較好的AAP3作為多糖衍生的原料。

表4 多糖AAP1、AAP2、AAP3對PT、APTT和TT的影響Table 4 Effect of polysaccharide AAP1，AAP2 and AAP3 on PT，APTT and TT

2.4.2 衍生化多糖與未衍生化多糖體外抗凝血功能對比 從表5中的數據可觀察到衍生后的多糖對體外抗凝血效果大大增加，可能因為轉化后多糖的溶解度增加，粘度減低，從而使多糖活性增強[11]。

表5 轉化的多糖（AAP3-I）對PT、APTT和TT的影響Table 5 Effect of conversion polysaccharide on PT，APTT and TT

3 結論

木耳多糖能延長血漿凝固時間，并且經過酰基化修飾后，能明顯提高其抗凝血效果，具有被開發成功能食品或者藥品的潛在價值。采用具有較好抗凝血作用的級分AAP3加入對羥基苯甲酸制備木耳多糖衍生物，并通過響應面優化實驗研究，得到酰基化合成修飾的最優工藝條件為：轉化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。根據最優工藝條件制備得到的木耳多糖酰基化后的多糖衍生物的轉化率約為27.26%，符合藥理性研究要求，該方法操作簡單，反應條件相對簡單、產物回收方便，是一種較理想的衍生化方法。

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Study on derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular

ZHANG Zhi1，LIU Dong-min1，+，HU Jun-fei1，WANG Zhen-yu2，*，YU Zhen1
（1.Department of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

Derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular was optimized by using Response Surface Methodology，and examining the effect of anticoagulant in vitro after polysaccharide transforming as well.The results showed that selecting p-hydroxybenzoic acid as acyl donor，the best process condition of derivatization of conversion temperature of 55℃，the ratio of polysaccharide to acyl donor of 10∶1，polysaccharide concentration of 0.50mg/mL，that was the most effective condition.The optimal conversion rate was 27.26% under this condition.Conversion polysaccharide could improve the effect of anticoagulant in vitro.

Auricularia auricular polysaccharide；derivatization；response surface methodology；anticoagulant

TS201.1

B

1002-0306（2014）20-0263-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.049

2014－01－15 +為并列第一作者

張智（1964-），女，博士，博士生導師，教授，研究方向：天然產物生物轉化。劉東敏（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學。

* 通訊作者：王振宇（1957-），男，博士，教授，研究方向：天然產物分離與功能性食品開發。