魚鱗膠原多肽的制備研究

周 亮，程 威，胡文翠，吳正奇，*

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430068）

魚鱗膠原多肽的制備研究

周 亮1，程 威2，胡文翠3，吳正奇1，*

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430068）

利用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化熱水法提取魚鱗膠原蛋白工藝，使用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化膠原多肽酶解工藝。最佳提取工藝為：溫度70℃，時(shí)間6h，料液比1∶20，膠原蛋白的得率為32.55%；酶解最佳工藝為：pH9.5，溫度55℃，時(shí)間2.0h，酶量0.3%，最大水解度達(dá)23.17%；用氨基酸自動(dòng)分析儀和凝膠滲透色譜法測(cè)定膠原多肽氨基酸分布情況和分子質(zhì)量，結(jié)果表明：氨基酸組成符合膠原蛋白特征，膠原多肽分子質(zhì)量大部分在1000u以內(nèi)。

魚鱗，膠原蛋白，酶解，膠原多肽，分子質(zhì)量

魚鱗主要由蛋白質(zhì)和羥基磷灰石組成，脂肪含量極少（＜1%），蛋白質(zhì)占魚鱗總質(zhì)量的50%～70%，其中膠原蛋白（12%～38%）含量豐富，是制備水解膠原多肽的良好原料[1]。膠原多肽源于動(dòng)物蛋白，其分子結(jié)構(gòu)和植物蛋白相比更適合人體吸收，它不僅具有一般蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)作用，還具有不可替代的調(diào)節(jié)功能和良好的營(yíng)養(yǎng)特征，人體吸收率達(dá)90%以上[2-4]。

傳統(tǒng)膠原蛋白的提取多采用酸堿脫鈣脫脂處理，周期長(zhǎng)，步驟繁瑣，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求高，成本較高，但得率低[5-7]。本文以草魚鱗為原材料，采用熱水法直接將膠原蛋白從魚鱗中分離出來，然后以高活性的堿性蛋白酶酶解獲取分子質(zhì)量較小的膠原多肽。魚鱗膠原蛋白在40℃以上變性降解成明膠溶于熱水中[8-9]，能有效地從魚鱗中分離出來，步驟簡(jiǎn)單，成本低，得率高，品質(zhì)好[10]。人體吸收蛋白質(zhì)主要以多肽的形式，分子量在1000u以下的多肽無需分解可被人體直接吸收；合理利用魚鱗制備膠原多肽不僅可以推動(dòng)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，還能夠變廢為寶，減少環(huán)境污染，也為解決補(bǔ)膠原蛋白問題開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草魚魚鱗 收集于湖北工業(yè)大學(xué)南門菜市場(chǎng)；氫氧化鈉、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、鹽酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

UV-2000型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SXJQ-1型數(shù)顯直流無級(jí)調(diào)速攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊是有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AR2140型分析天平 美國奧豪斯公司；TDL-50B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DELTA 320型pH計(jì) 梅特勒儀器有限公司；QSL-08型消化爐、QSY型自動(dòng)定氮儀 上海愛朗儀器有限公司；氨基酸自動(dòng)分析儀 上海仁特檢測(cè)儀器有限公司；TSKgel2000SWXL型凝膠柱 日本TSK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚鱗主要成分的測(cè)定 原料預(yù)處理：將草魚鱗洗干凈，晾干魚鱗表面的水分，部分用于測(cè)定含水率，其他的置于鼓風(fēng)干燥箱烘干，密封保藏。

水分測(cè)定：恒溫干燥法（GB/T 5009.3-2010）；灰分測(cè)定：高溫灼燒法（GB/5009.4-2010）；總氮含量測(cè)定：凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）；脂肪含量的測(cè)定：酸水解法（GB/T 21514-2008）。

1.2.2 膠原蛋白的提取 取相同質(zhì)量（5g）的干魚鱗進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，將提取的膠原蛋白定容至相同體積，再取一定體積溶液測(cè)定吸光度。明膠與雙縮脲試劑反應(yīng)的吸光度（560nm）與蛋白含量成正比，比較吸光度大小確定最佳提取工藝條件。由于影響條件時(shí)間、溫度和料液比相互間的影響極小，獨(dú)立性比較強(qiáng)，并且各單因素實(shí)驗(yàn)水平梯度較小，單因素實(shí)驗(yàn)就能夠較確定最佳取值。

1.2.2.1 提取膠原蛋白的工藝優(yōu)化 影響提膠的主要影響因素有溫度、時(shí)間和料液比。通過比較明膠（相同體積）與雙縮脲試劑反應(yīng)的吸光度大小，確定最佳熬膠條件。

a.取溫度70℃，料液比1∶25，時(shí)間的選擇：設(shè)計(jì)3、4、5、6、7、8h 6個(gè)水平，確定最佳提取時(shí)間。

b.取時(shí)間6h，料液比1∶25，提取溫度的選擇：設(shè)計(jì)50、60、70、80、90℃ 5個(gè)水平，確定最佳提取溫度。

c.取溫度70℃，時(shí)間6h，料液比的選擇：設(shè)計(jì)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 5個(gè)水平，確定最佳提取料液比。

1.2.3 膠原蛋白的酶解工藝優(yōu)化

1.2.3.1 酶解水解度測(cè)定 影響膠原蛋白酶解的因素有底物濃度、溫度、時(shí)間、pH、酶添加量，實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)的水解度為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解工藝，采用pH-state法[11]測(cè)定水解度。取固定濃度為3.2%膠原蛋白液50mL，添加標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（0.5mol/L），用于保持水解液中的pH穩(wěn)定，記錄下消耗堿液的體積，代入公式即可求得水解度。

水解度的公式為：

式中：DH—水解度；Nb—NaOH的摩爾濃度（mol/L）；B—消耗堿量（mL）；MP—底物蛋白的質(zhì)量（g）；htot—每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，膠原蛋白取8.41；α—α-氨基的平均解離度。

平均解離度公式為：

式中，pH—水解液的酸堿度；pK—-NH3解離常數(shù)。

1.2.3.2 水解度單因素實(shí)驗(yàn) a.取時(shí)間2.0h，pH9.5，酶添加量0.3%，設(shè)計(jì)40、45、50、55、60、65、70℃7個(gè)水平，確定酶解溫度對(duì)水解度影響的變化趨勢(shì)。

b.取溫度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，設(shè)計(jì)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h 5個(gè)水平，確定酶解溫度對(duì)水解度影響的變化趨勢(shì)。

c.取時(shí)間2.0h，溫度55℃，酶添加量0.3%，設(shè)計(jì)pH8.5、9.0、9.5、10、10.5 5個(gè)水平，確定酶解pH對(duì)水解度影響的變化趨勢(shì)。

d.取 時(shí) 間 2.0h，溫 度 55℃ ，pH9.5，設(shè) 計(jì) 0.1% 、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5個(gè)水平，確定酶添加量對(duì)水解度影響的變化趨勢(shì)。

1.2.3.3 正交實(shí)驗(yàn) 取酶解溫度、時(shí)間、pH、酶（質(zhì)量濃度20%堿性蛋白酶溶液）添加量為主要參考因素，以水解度為指標(biāo)，采用正交表L9（34）進(jìn)行4因素、3水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 L9（34）Factors and levels of orthogonal design

1.2.4 膠原多肽分子質(zhì)量分布及氨基酸組成測(cè)定 以最佳工藝條件制備魚鱗膠原多肽，分別采用氨基酸自動(dòng)分析儀（湖北省農(nóng)科院農(nóng)檢所）和凝膠滲透色譜法（湖北工業(yè)大學(xué)魔技術(shù)研究所）測(cè)定氨基酸組成及分子質(zhì)量分布。

采用陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對(duì)蛋白質(zhì)水解氨基酸的組分含量進(jìn)行分析，測(cè)定在pH5～5.5、100℃下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為10～15min，利用比色法將生成的紫色物質(zhì)在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

色譜柱：TSK gel G2000SWXL（7.8mm×cm，Tosoh）；流動(dòng)相：乙腈/水/三氯乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）；柱溫；39℃ ；檢 測(cè) 波 長(zhǎng) ：220nm；流 速 ：0.8mL/min；進(jìn) 樣 量 ：20μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 檢測(cè)結(jié)果經(jīng)檢測(cè)方處理后再整理。做一個(gè)氨基酸全分析一般只需1h左右，同時(shí)可將幾十個(gè)樣品一起裝入儀器，自動(dòng)按序分析，最后自動(dòng)計(jì)算給出精確的數(shù)據(jù)，取三組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。膠原多肽的分子質(zhì)量具有多分散性，其分子質(zhì)量具有統(tǒng)計(jì)平均的意義，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算不同區(qū)域分子質(zhì)量的膠原多肽平均百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚鱗基本化學(xué)組成

新鮮草魚鱗的含水量約為20.25%。干草魚鱗的主要成分見表2，可知草魚鱗中含有豐富的粗蛋白，粗蛋白含量占干物質(zhì)約66.06%，灰分約占干物質(zhì)約31.79%，而脂肪含量＜1%，其他雜質(zhì)含量極小。灰分在中性環(huán)境中難容，加熱條件下，角蛋白不溶于水，而膠原蛋白會(huì)降解成明膠而溶于熱水中，其他雜蛋白因加熱變性沉淀出，通過熱水法制備膠原蛋白簡(jiǎn)單、方便、節(jié)約成本，還可以提高蛋白的純度。

表2 草魚鱗的基本化學(xué)組成Table 2 Basic chemical composition of grass fish scales

2.2 膠原蛋白的提取

熱水法提取膠原蛋白的影響因素主要有料液比、pH、溫度和時(shí)間，由于此法以軟水為介質(zhì)，不添加酸和堿，故pH對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響不考慮。熱水法提取膠原蛋白在節(jié)約時(shí)間及成本的情況下，得率也較高，測(cè)定吸光度曲線可以定性地反映蛋白濃度變化趨勢(shì)，可快速、有效地比較各單因素實(shí)驗(yàn)的提取效果。

2.2.1 時(shí)間對(duì)提膠的影響 由圖1可知，溫度和料液比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性膠原蛋白量越來越多，當(dāng)時(shí)間超過6h繼續(xù)延長(zhǎng)熬膠時(shí)間，膠原蛋白質(zhì)量的增加并不明顯，可能魚鱗中絕大部分膠原蛋白已經(jīng)溶出，少量與羥基磷灰石結(jié)合緊密的膠原蛋白難以溶出，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液的水分蒸發(fā)，溶液中膠原蛋白達(dá)到平衡狀態(tài)，魚鱗中膠原蛋白不再繼續(xù)溶出。

圖1 時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.2.2 溫度對(duì)提膠的影響 由圖2可知，時(shí)間和料液比一定時(shí)，隨著溫度的升高，可溶性膠原蛋白越來越多，溫度到70℃左右時(shí)，膠原最多，隨著溫度繼續(xù)升高，膠原蛋白質(zhì)量逐漸降低，一方面可能高溫條件下，溶液中的水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致溶液中膠原蛋白濃度增大，促使了溶質(zhì)快速達(dá)到平衡狀態(tài)，從而影響了膠原蛋白濃度溶出，另一方面長(zhǎng)時(shí)間高溫條件，導(dǎo)致一部分蛋白質(zhì)降解成分子質(zhì)量小的物質(zhì)隨水蒸氣揮發(fā)掉。

2.2.3 料液比對(duì)提膠的影響 由圖3可知，溫度和時(shí)間一定時(shí)，可溶性膠原蛋白隨料液比增大而先增后降，料液比為1∶20時(shí)，膠原蛋白的溶出量達(dá)到最大。料液比太小，水添加量少，干魚鱗難以溶脹，膠原蛋白不易擺脫羥基磷灰石的束縛，并且溶液中膠原蛋白濃度容易很快達(dá)到飽和狀態(tài)，加上攪拌不均勻，不利于膠原蛋白的溶出。

圖2 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 The effect of material to liquid ratio on the extraction rate of collagen

取3份一定量的干燥魚鱗在最佳提取條件時(shí)間6h、溫度70℃和料液比1∶20的條件下制備蛋白，其平均提取率可達(dá)到32.55%，在魚鱗含12%～38%膠原蛋白的范圍內(nèi)。

2.3 膠原蛋白的水解

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在膠原蛋白濃度固定的情況下，影響膠原蛋白酶解的主要因素為溫度、時(shí)間、pH、酶添加量。

2.3.1.1 時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖4可知，溫度、pH和酶添加量不變時(shí)，膠原蛋白水解度隨著時(shí)間的增加而升高，當(dāng)時(shí)間超過1.5h后，水解度保持平緩，可能隨著酶解的進(jìn)行，底物濃度降低，并且長(zhǎng)時(shí)間的酶解使蛋白酶的酶活性下降，導(dǎo)致酶解速率下降，也可判斷膠原蛋白基本酶解完全，延長(zhǎng)酶解時(shí)間，不僅消耗更大，還會(huì)使膠原蛋白酶解成分子質(zhì)量更小的氨基酸，影響膠原多肽的品質(zhì)。

圖4 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 The effect of time on the extraction rate of collagen

2.3.1.2 溫度對(duì)水解度的影響 由圖5可知，時(shí)間、pH和酶添加量不變時(shí)，膠原蛋白的水解度在50～55℃較高，可知在此溫度范圍內(nèi)，堿性蛋白酶的活性最大，膠原蛋白的酶解速率最快，而溫度低，酶的活性受抑制，溫度太高，酶易失活，均會(huì)降低酶解速率。

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

2.3.1.3 pH對(duì)水解度的影響 由圖6可知，溫度、時(shí)間和酶添加量不變時(shí)，膠原蛋白的水解度在pH9.5左右最大，說明在此pH條件下，堿性蛋白酶的活性最大，酶解效果最好，而pH太低或太高，酶的活性受抑制，均會(huì)降低酶解速率。

圖6 pH對(duì)水解度的影響Fig.6 The effect of pH on the extraction rate of collagen

2.3.1.4 酶量對(duì)水解度的影響 由圖7可知，在溫度、時(shí)間和pH不變時(shí)，膠原蛋白的水解度隨著酶添加量增大先升高后平穩(wěn)，說明酶添加量在0.2%～0.3%范圍內(nèi)已經(jīng)達(dá)到飽和，再增加酶量也不能提高膠原蛋白的水解度，即在酶量達(dá)到飽和狀態(tài)下對(duì)酶解最適宜。2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 由正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果（表3）可知，影響膠原蛋白水解的因素主次順序?yàn)椋篈＞D＞ B＞C，即時(shí)間和酶添加量對(duì)膠原蛋白酶解的影響比較大，而溫度和pH影響相對(duì)較小，最佳酶解條件組合為：A3B3C2D3，即時(shí)間2.0h，溫度55℃，pH9.5，酶添加量0.3%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明此條件下的最大水解度達(dá)23.17%，比正交實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)組合所得結(jié)果（21.21%）大。

圖7 酶添加量對(duì)水解度的影響Fig.7 The effect of temperature on the extraction rate of collagen

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The test data of orthogonal of four factors in three-level list

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal results

由于因素C（pH）的極差為0.6，很小，故可將它的方差分析忽略不計(jì)，故可做如表4的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析。由方差分析結(jié)果看出，在本實(shí)驗(yàn)中A、D因素的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響非常顯著（p＜0.05），其中A比D顯著，而B、C因素的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)影響不顯著（p＞0.05），即時(shí)間和酶添加量對(duì)酶解的影響顯著，而溫度和pH影響不顯著，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析一致。

2.4 膠原多肽氨基酸組分及平均分子質(zhì)量

2.4.1 氨基酸的分布情況 通過氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，由表5可知，膠原多肽中甘氨酸含量為22.5496%，羥脯氨酸含量為10.1265%，脯氨酸含量氨基酸含量12.9158%，色氨酸未檢測(cè)出，氨基酸組成符合膠原蛋白的特征。

表5 膠原多肽氨基酸的分布Table 5 The composition of the amino acids

2.4.2 分子質(zhì)量的分布情況 魚鱗水解膠原多肽分子質(zhì)量分布見表6，堿性蛋白酶水解的魚鱗膠原蛋白的分子質(zhì)量在1638～451.5u的多肽占11.66%，分子質(zhì)量451.5u的多肽占69.76%，分子質(zhì)量451.5～189.7u的多肽占18.42%，即大部分水解膠原多肽的分子質(zhì)量在1000u以內(nèi)，適合人體的吸收。

表6 分子質(zhì)量分布Table 6 Distribution of molecular mass of collagen peptide

3 結(jié)論

熱水法提取膠原蛋白是提取魚鱗膠原蛋白的綠色方法，在時(shí)間6h、溫度70℃和料液比1∶20的最佳提取工藝條件下，魚鱗膠原蛋白的得率達(dá)到32.55%，能夠提取出魚鱗中大部分膠原蛋白，并且實(shí)驗(yàn)中雙縮脲法快速簡(jiǎn)單，定性準(zhǔn)確，有效減少了實(shí)驗(yàn)量。但是實(shí)驗(yàn)中由于草魚鱗韌性較大，不易粉碎，一定程度上增加了提取時(shí)間和降低了提取率。

在時(shí)間2.0h、溫度55℃、pH9.5、酶添加量0.3%的最佳酶解條件下，膠原多肽的水解度達(dá)到23.17%，制備的膠原多肽的氨基酸分布符合理論要求，并且膠原多肽的分子質(zhì)量較小，適合人體的吸收利用。

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Study on extracting collagen polypeptide from fish scale

ZHOU Liang1，CHENG Wei2，HU Wen-cui3，WU Zheng-qi1，*
（Food and Pharmaceutical Engineering Institute，Light Industry Department，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Using single factor experiments to optimize technology that hot water was used to extract collagen from fish scale.Then，using orthogonal experiments to optimize the enzymolysis technology of collagen peptide that were studied.When extraction temperature of solution was 70℃ ，extraction time was 6 hours and ratio of material to solvent was 1 ∶20，the optimum extraction process was obtained，and the maximum yield was 32.55%.When the pH of solution was 9.5，the temperature of solution was 55℃，the reaction time was 2.0 hours and amount of enzyme was 0.3% （v/v） ，the optimum extraction process of collagen enzyme was obtained，and the largest degree of hydrolysis was 23.17%.Automatic amino acid analyzer was used to measure amino acids of collagen polypeptide distribution，its amino acid composition was according with the characteristic of collagen.Gel permeation chromatography was used to determine the molecular mass of collagen peptide ，most of the molecular mass of collagen peptide was within 1000u.

fish scale；collagen；enzymatic hydrolysis；collagen polypeptide；molecular mass

TS254.9

B

1002-0306（2014）20-0327-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.063

2014-01-16

周亮（1987-），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

* 通訊作者：吳正奇（1966-），男，教授，研究方向：蛋白質(zhì)資源利用和食品加工新技術(shù)與新工藝。