兒童急性淋巴細胞白血病微小殘留病的流式細胞術檢測分析

陳彥明　戴鳳燕

[摘要] 目的 探討流式細胞術檢測微小殘留?。∕RD）在兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）治療中的臨床價值。 方法 用多種四色熒光抗體組合檢測50例正常兒童骨髓，據此建立雙參數點圖分析模型，500例ALL初發患兒行流式細胞分析，選出異于正常骨髓細胞免疫表型組合來檢測MRD，根據確定好的免疫表型組合對105例患兒誘導治療結束及后續治療中的骨髓標本行MRD監測，同步行細胞形態學檢測和PCR檢測。 結果 流式細胞術檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細胞受體基因重排；細胞形態學對誘導治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%，流式細胞術的MRD陽性檢出率為91.43%。 結論 流式細胞術能對ALL患兒治療期間的MRD作出準確評估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應用。

[關鍵詞] 急性淋巴細胞白血病；微小殘留??；流式細胞術

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1674-4721（2014）02（a）-0171-03

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leuke- mia，ALL）嚴重影響患兒健康發育，3～4歲是其高發年齡，發熱、貧血、肝脾腫大等是其早期癥狀。臨床報道指出個體化治療對ALL患者尤為重要[1]，治療強度應當同其復發風險相適應。微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）是經過誘導化療或骨髓移植治療后體內仍殘留的白血病細胞形態，它是誘發白血病復發的根源，逐漸被納入指導個體化治療的關鍵性指標[2]。目前聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和流式細胞術是MRD兩種檢查方法，本研究探討分析流式細胞術檢測MRD在兒童ALL治療中的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2009年1月～2012年12月于本院接受誘導緩解治療的500例ALL患兒，男性296例，女性204例，年齡1～8歲，平均（4.2±1.2）歲，上述病例經細胞形態學、免疫學、遺傳學和分子生物學等方法確診，B淋巴細胞白血病465例，T淋巴細胞白血病35例。同期行健康檢查的正常兒童50例，男性28例，女性22例，年齡1～10歲，平均（4.5±1.5）歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：O-Rid Cycler定量PCR儀（美國Bio-Rid公司），FACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD公司）；D10-藻紅蛋白（PE）、CD22-TC、CD13-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c（KOR-SA3544）-FITC、CD58-FITC、透膜劑IntraPrep（法國Immunotech公司）；CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血劑FACSLysing（美國Becton Dickin-son公司）；TdT-FITC（美國Supertechs公司）。

1.3 檢測方法

采集50例正常兒童的骨髓細胞，通過流式細胞術運用多種四色熒光抗體組合進行檢測，建立其雙參數點圖分析模型，所得結果同文獻[3-4]相符。根據正常兒童的雙參數點圖分析模型對500例ALL初發患兒行流式細胞分析，比較兩者的免疫表型組合的差異，選出異于正常骨髓細胞免疫表型組合來檢測MRD，對數據進行存檔。從中選取誘導治療結束及后續治療的患兒的骨髓標本（105例）行流式細胞術，調用先前存檔比較相同病例的數據，雙參數點圖原白血病細胞位置仍出現細胞則可判定白血病殘留細胞，殘留細胞占骨髓有核細胞總數比例記為MRD檢測值。500例患兒同時行細胞形態學檢查和PCR檢查，按照儀器操作說明進行，將結果同流式細胞術的檢測結果進行對比分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

流式細胞術檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細胞受體基因重排，兩者比較差異有統計學意義（P<0.01）；細胞形態學對誘導治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%，35例未檢測出MRD，流式細胞術的MRD陽性檢出率為91.43%，兩者比較，差異有統計學意義（χ2=19.43，P<0.01）。

3 討論

MRD對兒童ALL的臨床療效和預后判定有重要價值[5]，以往檢測MRD的方法包括形態學檢查、染色體核型分析、熒光原位雜交技術、異倍體細胞技術等，但上述方法的有效覆蓋范圍和敏感性均較差，不適于作為MRD的檢測手段[6]。隨著科技的發展，流式細胞術和PCR逐漸應用于該病灶的檢測[7]。成年急性非淋巴細胞白血病的MRD檢測中，融合基因覆蓋面較廣，體內存在也較穩定，因此PCR對其檢測效果較好[8]，但兒童ALL的融合基因缺乏特異性，單基因的覆蓋面相對較小，因此其在兒童ALL中的應用價值存在一定的局限性[9]。本次檢測結果顯示500例患兒PCR后僅142例檢測出MRD，流式細胞術462例檢測出MRD，明顯多于PCR，此結果說明流式細胞術具有較廣的覆蓋面。本研究建立了科學的檢測方法，通過異常免疫表型特征與正常細胞間的區別來檢測MRD，白血病細胞的某些抗原表達質和量均存在較大的差異，通過抗原表達同正常細胞間的差異就可以對MRD進行區分[10]，聯合多種抗原檢測更增強了兩者間的差異性。本文通過對105例患兒誘導治療結束及后續治療中的骨髓標本行MRD監測，進一步證實形態學檢查對MRD的敏感性遠低于流式細胞術，和相關報道基本相符[11]。白血病治療過程中部分患者會發生抗原表達改變，因此采取多個免疫表型組合來檢查MRD能夠較好地避免假陽性[12]。另外需要加強標本的處理，對細胞數、抗體量、孵育時間及離心速度等做到標準化，降低其對檢測結果的影響，提高檢出效果[13]。

綜上所述，流式細胞術能對ALL患兒治療期間的MRD作出準確評估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應用。

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（收稿日期：2013-12-02 本文編輯：魏玉坡）