椎間盤退行性變組織工程研究進展＊

白亦光 綜述 馮 剛 審校

（川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000）

腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一，其一旦發生，難以逆轉［1，2］。傳統的治療方法如微創［3］、介入［4］等治療只能緩解臨床癥狀，不能從根本上解決問題［5］。近年來，組織工程的出現，特別是髓核和纖維環組織工程研究的不斷深入及自體椎間盤細胞移植修復髓核退變動物實驗的初見成效，為此類疾病的治療帶來了光明的前景。利用組織工程方法修復退變的椎間盤是具有變革性意義的新的治療探索。組織工程是以細胞為核心的生物移植工程，其核心內容包括：種子細胞，可供細胞貼附生長的生物支架或細胞外基質，用以促進組織再生的生長因子及基因修復技術。組織工程技術的興起及其在臨床不同領域的應用，為椎間盤退變疾病的治療帶來了新的思路。本文就椎間盤退行性變組織工程研究進行綜述。

1 種子細胞

種子細胞指在組織工程中培養存活增殖最后形成組織的原始細胞，種子細胞是體外構建工程組織器官最為重要的材料。種子細胞一般需滿足三個條件：①具有特定的分化表型或定向分化潛能。②容易獲得的細胞來源及良好的體外擴增效率。③在體內不引發免疫排斥反應。

1.1 髓核細胞 髓核組織內的細胞在胚胎時期為脊索細胞，在正常成年人體內主要以類軟骨細胞為主［6］。髓核細胞主要表達蛋白多糖和Ⅱ型膠原，在椎間盤維持脊柱穩定記憶承受壓力方面發揮著重要的作用，但其體外增殖能力較弱，其組織內含量也極為有限，培養過程要求非常嚴格。Gan等［7］發現，在單層培養時，細胞增殖能力較強，而球狀培養時，細胞形態會發生部分改變，而體內的髓核細胞也表現為這種特征，細胞活力強，但細胞的分裂增殖能力差，可以分泌大量的蛋白多糖等細胞外基質。他們認為髓核細胞由一維生長環境培養轉變為三維生長的環境中時會細胞的特征可以得到部分恢復，體外的一些形態學及免疫組化的鑒定方法可以支持這些結論，他們認為這種特點的細胞可供椎間盤組織的修復。

1.2 骨髓間充質干細胞（MSCs） 許多動物實驗研究顯示，利用自體MSCs來阻止退變椎問盤的進一步發展或治療已經退變的椎間盤，都獲得了非常滿意的治療效果。由于MSCs為體內的一種多能分化干細胞，具有良好的分化特性。所以經常被用作組織工程的種子細胞。Sakai等［8，9］將 MSCs注射植入膠原基質中。MSCs可存活超過4周，將MSCs膠原基質復合體植入經髓核吸出術誘導退變的兔椎間盤后。椎間盤內蛋白多糖含量明顯增加。Jeong等［10］用8只S－D大鼠尾部椎間盤造模處理后，將人類MSCs移植入大鼠尾部退變的椎間盤，觀察MSCs在大鼠退變的椎間盤模型中的存活情況，結果顯示，處理組的影像學表現為高度增加，髓核細胞結構恢復；而空白組的影像學顯示髓核結構進行性破壞，高度進行性降低。上述研究結果表明，雖然自體 MSCs植入不能完全再生椎間盤，但是它確實能在某種程度上延緩甚至阻止椎間盤的退變過程。1.3 脂肪間充質干細胞（ADSCs） Ganey等［11］在利用犬自身的脂肪來源的干細胞修復受損的椎間盤實驗中驗證了ADSCs對受損椎間盤的修復作用。結果表明，由ADSCs修復再生的椎間盤治療效果明顯。隨著椎間盤退變病因機制的認識逐漸深入，種子細胞研究的深入發展，特別是新型種子細胞的出現，如近年來的研究熱點——誘導性多潛能干細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPS cells），在未來種子細胞研究中將占據非常重要的地位［12］。iPS細胞是通過使用逆轉錄病毒將四種轉錄因子（Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4）載入小鼠皮膚成纖維細胞，篩選之后，發現其中具有干細胞形態的細胞群落并表達胚胎干細胞特異的表面抗原，且具有多能性、分化性［13］。iPS細胞技術的出現，為構建完整組織工程椎間盤研究和對IDD的細胞治療帶來了新的希望。

2 細胞支架

支架材料在組織工程研究中起著替代細胞外基質或組織、器官基質的作用，主要功能是為組織或器官體外構建提供立體的生長環境。較為理想的組織工程支架應具有如下特點：①良好的組織相容性。②良好的生物聚合性和降解性。③抗原性較低或缺如。④具有三維立體多孔結構。⑤有良好可塑性和力學性能［14］。

2.1 殼聚糖 殼聚糖是一種高分子聚合物，其分子結構與軟骨基質糖胺多糖相似。殼聚糖在組織工程中具有廣泛應用，具有無組織細胞毒性作用，良好的生物相容性和預防創傷性軟骨退變等優點，其降解產物可作為硫酸角質素、硫酸軟骨素的合成原料，是軟骨細胞生長的重要物質［15］。

Roughley等［16］將磷酸甘油鈉與殼聚糖混合，制備出包裹細胞的組織工程支架，研究者在支架上分別培養髓核細胞和纖維環細胞，結果表明這種水凝膠支架可以較好地保留髓核細胞分泌的細胞外基質，也更有利于髓核細胞的再生，殼聚糖–磷酸甘油混合支架不僅能促進髓核細胞生長，還具有一定的誘導作用，可誘導干細胞向髓核和軟骨方向分化。Richardson等［17］將間充質干細胞種植到殼聚糖–磷酸甘油支架上，發現間充質干細胞存支架上培養4周后，能表達出髓核和軟骨細胞的特異性基因SOX－9、COLⅡ和Aggrecan.表明這種支架可以誘導干細胞向髓核和軟骨分化。殼聚糖支架的缺陷在于其機械性能較差，且在生理環境中降解過快，不能完全滿足組織工程髓核支架的需求。這也限制了殼聚糖支架的進一步應用。

2.2 藻酸鹽 藻酸鹽具有低毒、組織相容性好、價格低廉等特點，可以作為組織工程材料。Iwashina等［18］認為，將兔椎間盤細胞種植于藻酸鹽微球上，在一定強度超聲脈沖干預下培養增殖，發現椎間盤細胞增殖更快且有更多的細胞外基質產生。

2.3 膠原 膠原是一種廣泛存在于動物體內的天然蛋白質，常被用于制備組織工程支架。端膠原是膠原的一種衍生物，具有溫度敏感性，在4℃以下保持液體狀態，而在37℃下可以轉變為凝膠。這種溶膠–凝膠的轉變使得端膠原可以作為可注射的髓核組織工程支架。Daisuke等［19］以海藻酸鹽支架作為對照組，考察了端膠原作為髓核支架的可行性，結果表明，在端膠原支架上生長的髓核組織的水溶性較好，能較好地保留髓核分泌的蛋白多糖，從而更有利于髓核組織的再生。

2.4 脂肪族聚酯類 脂肪族聚酯中聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物聚。乳酸聚羥基乙酸共聚物是一類具有生物相容性，塑型簡單，體內可降解吸收的合成高分子材料。Sha＇ban等［20］將纖維環及髓核細胞種植在纖維蛋白–聚乳酸聚羥基乙酸共聚物支架上獲得良好的培養效果，認為此移植物有利于椎間盤退變的修復。Wan等［21］研究發現，軟骨細胞能在聚合材料上存活，并分泌Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等細胞外基質。

3 生長因子

多項研究表明，多種細胞因子與椎間盤細胞的分化增殖和細胞外基質的合成代謝有關。將這些細胞因子應用于動物實驗，也表現出良好的作用效果。

3.1 轉化生長因子–β（TGF－β） 基于TGF－β與椎間盤退變的關系，國內外許多學者通過多種途徑探索TGF－β1阻止或逆轉椎間盤的退變［22］。他們認為TGF－β1是一種較為穩定的多功能多肽生長因子，在動物體內具有重要的代謝作用，幾乎參與了哺乳動物各種組織細胞的體內代謝過程，并能提高髓核細胞體外培養時的細胞外基質的合成及分泌作用［23］。Thompson等［24］也證實TGF－β1對犬椎間盤細胞體外細胞外基質的合成及分泌作用，認為TGF－β1對于髓核細胞的作用遠比對纖維環細胞的作用強。

3.2 骨形態發生蛋白–7（BMP－7） 骨形態發生蛋白–7（bone morphogenefic proteins，BMP–7）由于其對軟骨細胞纖維環細胞及髓核細胞合成代謝具有顯著促進作用已成為國內外眾多學者的研究熱點［25］。An等［26］將BMP–7注入兔退變椎間盤，并以生理鹽水作為對照。2周時注射BMP－7的椎間盤高度較生理鹽水對照組高出15%，4周及8周時觀察仍具有統計學差異。同時BMP–7還促進了椎間盤內蛋白多糖的合成。Imai等［27］使用軟骨素酶ABC對新西蘭兔髓核進行化學溶解，使得處理節段椎間隙高度下降獲得椎間盤退變動物模型，將重組基因BMP–7注射入退變的椎間盤內，2周后發現處理組髓核組織內細胞外基質成分，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量等以及水分得到了很好的保持，椎間隙高度得到了部分恢復，并且高度一直維持到第3個月，此實驗證實了BMP–7生長因子對于退變椎間盤內的髓核有明顯的修復作用。此外，還有一些生長因子具有調整細胞的增殖、分化以及細胞基質代謝的作用。但需引起注意的是，現有的研究結果絕大部分來自動物實驗和體外細胞培養，除物種差異外，椎間盤細胞的體外培養條件與體內椎間盤組織和細胞的內環境也有明顯差異。

4 基因技術

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是近年來發展起來的一項基因技術，可高效、快捷、特異地抑制目的基因的表達。MeCaffrey等［28］等將針對熒光素酶的siRNA和特異表達熒光素酶的質粒同時轉染至成年小鼠的肝臟細胞，觀察到熒光素酶的表達受到特異的抑制，證實了RNAi技術可以動物體內產生高效基因沉默效應。

Kakutani等［29］在實驗中將雙報告基因質粒（Firefly熒光素酶和Renilla熒光素酶）及針對Firefly熒光素酶的siRNA轉染至體外培養的人和大鼠髓核細胞。觀察到，在siRNA介導下人和大鼠髓核細胞中Firefly熒光素酶的基因表達受到顯著抑制，作用持續達兩周，而未見明顯抑制外源性基因Renilla熒光素酶基因表達。由此證明，RNAi技術對椎間盤細胞內源性基因具有高效的基因沉默作用。

5 小結與展望

組織工程技術為失去功能的退變椎間盤組織的再生提供了可能性。但組織工程在椎間盤領域的研究相對較少，目前仍存在許多包括倫理道德和技術層面在內的問題。我們認為，在椎間盤退變疾病的治療領域中，較為有希望的治療策略是：在退變早期或者在椎間盤輕微退變時，采用基因治療以及基于蛋白生長因子的治療方法是有效的；而在中期，采用細胞治療以及細胞聯合基因和生長因子的治療效果可觀，而在椎間盤退變晚期，由于髓核及纖維環的細胞凋亡明顯而且功能較差，恢復可能性小的情況下，我們認為采用整體椎間盤移植的方式較為合適。但由于體外整體椎間盤的合成組裝目前并沒有取得突破性進展，本實驗室正在致力于這方面的研究，相信不久的將來，我們可以將組織工程技術用于攻克此類疾病。

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