原發(fā)性三叉神經(jīng)痛基因治療的實驗研究進展

秦泗佳 王福 張奎啟 高璐 金海威

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛有臨床癥狀但無與發(fā)病有關(guān)的器質(zhì)性或功能性病變，陣發(fā)性劇痛是其疼痛特點，且疼痛的程度隨病程的延長而加重，疼痛發(fā)作的頻率也會逐漸增加。原發(fā)性三叉神經(jīng)痛發(fā)病率約8/10萬，平均發(fā)病年齡(62.7±15.8)歲，據(jù)臨床癥狀可將其分為典型和不典型[1]。隨著社會生活水平的提高，人的壽命不斷延長，高齡人群不斷增多，該病的發(fā)病率也逐漸增高[1]。因其病因和發(fā)病機制尚未明確，所以尚無成熟可靠的治療方法。主要的治療方法有藥物、手術(shù)、放射、中醫(yī)、基因和其他療法等，每種方法各有利弊。近年來采用基因手段治療三叉神經(jīng)痛成為研究的熱點，本文著重從基因治療方面對近年來國內(nèi)外相關(guān)的實驗研究作一綜述。

一、基因治療疼痛的原理及技術(shù)

1.基因治療疼痛的原理

基因治療疼痛是通過上調(diào)抗痛基因或下調(diào)疼痛基因的表達來實現(xiàn)的。前者通過基因重組技術(shù)將抗痛基因、調(diào)控因子基因和疼痛相關(guān)受體基因插入到轉(zhuǎn)運載體，再將重組的載體導入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，作用于初級傳入神經(jīng)和脊髓背角；后者利用反義寡核苷酸下調(diào)神經(jīng)內(nèi)源性疼痛基因的表達或下調(diào)疼痛作用位點：蛋白激酶C、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和神經(jīng)調(diào)節(jié)素1受體等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)痛發(fā)作時，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生會出現(xiàn)變化，提示可通過相關(guān)載體介導產(chǎn)生這些神經(jīng)遞質(zhì)的基因靶向?qū)氚薪M織，通過改變相關(guān)遞質(zhì)的水平達到鎮(zhèn)痛目的。

2.基因治療疼痛的技術(shù)

主要的技術(shù)手段有基因的修復(fù)、置換、失活、修飾和免疫調(diào)節(jié)等。基因修復(fù)是指依照正常的基因結(jié)構(gòu)修復(fù)異常的基因使其恢復(fù)正常的基因結(jié)構(gòu)；將正常的基因?qū)氲酵蛔兊募毎麅?nèi)替換掉病變的基因稱為基因置換；利用反義寡核苷酸技術(shù)和RNA干擾(RNAi)技術(shù)有針對性地封閉病變的基因稱為基因失活；利用各種技術(shù)將所需的目的基因?qū)氲讲∽兊募毎胁⑦M行表達以改善或彌補病變細胞的相關(guān)功能稱為基因修飾；將目的基因?qū)氲交颊叩捏w內(nèi)，以改變患者的免疫功能稱為免疫調(diào)節(jié)。

二、基因治療疼痛的主要內(nèi)容

基因治療疼痛主要包括：鎮(zhèn)痛基因的選擇；鎮(zhèn)痛基因的擴增、測序；鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移載體；鎮(zhèn)痛基因靶組織的選擇；鎮(zhèn)痛基因表達的調(diào)控；試驗療效及安全性評價等。目前的研究多集中在鎮(zhèn)痛基因的選擇、鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移載體和鎮(zhèn)痛基因表達的調(diào)控等方面，故還需要加強對其它方面的研究。

1.鎮(zhèn)痛基因

鎮(zhèn)痛基因主要有阿片肽類、細胞因子類和RNAi。

阿片肽類主要包括腦啡肽、β-內(nèi)啡肽、孤啡肽、內(nèi)嗎啡肽和強啡肽5種，其作用機制是通過與體內(nèi)的阿片類受體相結(jié)合抑制疼痛信息的傳遞[1]。①1975年腦啡肽在豬腦中被發(fā)現(xiàn)，主要包括甲硫氨酸腦啡肽和亮啡肽兩種，它對δ受體有較強的選擇性，多種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可經(jīng)其介導的阿片受體作用產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。在大鼠鞘內(nèi)注入含有人前腦啡肽原基因的單純皰疹病毒Ⅰ型擴增子載體可轉(zhuǎn)染大鼠中樞神經(jīng)細胞，并在該細胞內(nèi)有效表達重組的腦啡肽基因，產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果。以慢病毒作為載體也同樣有良好的鎮(zhèn)痛效果。②β-內(nèi)啡肽的鎮(zhèn)痛效果要比腦啡肽強，能直接與脊髓的μ受體和ε受體結(jié)合，使腦啡肽的分泌增多從而產(chǎn)生更強的鎮(zhèn)痛效果。在大鼠鞘內(nèi)注入含有人β-內(nèi)啡肽基因的重組腺病毒后，大鼠腦脊液內(nèi)β-內(nèi)啡肽濃度明顯增高。③孤啡肽的氨基酸序列與強啡肽相似，它的受體是一種孤兒受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。在腦室內(nèi)注入微量的腦啡肽就能使大鼠的痛閾降低，還可抑制嗎啡的抗傷害鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但其作為目的基因還需要大量的基礎(chǔ)研究結(jié)果支持。④內(nèi)嗎啡肽對μ受體有高度的選擇性，其親和力強，主要分布在腦和脊髓。將內(nèi)嗎啡肽注入到腦和脊髓的蛛網(wǎng)膜下隙可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果，其對于炎性疼痛和神經(jīng)痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果，最適宜用于頑固性疼痛的治療，但目前的研究均只采用直接注射的方法，此法易產(chǎn)生耐受。⑤腦和脊髓的神經(jīng)元中均能分泌強啡肽，其在脊髓的作用復(fù)雜，正常水平時就能起到鎮(zhèn)痛的效果，在神經(jīng)受損后，腦脊液中的水平明顯升高。因其在脊髓痛覺調(diào)控中具有雙重調(diào)控作用，所以目前還沒有將其應(yīng)用于疼痛基因治療的研究。

細胞因子類主要包括免疫調(diào)節(jié)性細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子兩大類。①免疫調(diào)節(jié)性細胞因子主要以抑制神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)或類阿片肽的作用來治療疼痛，主要包括IL-2和IL-10。將含有能表達人源IL-2的重組腺病毒注入大鼠腦脊液內(nèi)，在大鼠的軟脊膜和各段脊髓實質(zhì)中能檢測到人源IL-2 mRNA的表達，說明注射能表達人源IL-2的重組腺病毒對慢性神經(jīng)病理性疼痛具有明顯的鎮(zhèn)痛效果。將含人IL-10基因的慢病毒載體經(jīng)鞘內(nèi)注射后，坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型大鼠痛覺異常明顯緩解，其脊髓、腦皮質(zhì)和海馬中的IL-10表達上調(diào)。②神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進特定神經(jīng)組織細胞的分化與再生，還可刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和改變神經(jīng)元特性。神經(jīng)營養(yǎng)因子主要包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3和神經(jīng)生長因子等，多用于神經(jīng)損傷或中毒導致的慢性神經(jīng)痛。黃愛蘋等[2]將慢病毒載體介導的BDNF基因與電針對神經(jīng)病理痛模型大鼠痛閾的影響進行比較，認為BDNF 參與了大鼠痛敏的過程，BDNF的表達有利于受損神經(jīng)修復(fù)。

RNAi是利用一種小片段干擾性雙鏈RNA作為效應(yīng)分子，催化與靶基因mRNA結(jié)合的級聯(lián)反應(yīng)，從而減少mRNA的含量。RNAi主要通過細胞內(nèi)正義鏈的聚合酶鏈反應(yīng)大量擴增干擾性RNA來干擾目的基因的表達。RNAi在植物及非脊椎動物的應(yīng)用中已有較多的研究報道，但在哺乳動物中尚未見成功的報道。

2.基因轉(zhuǎn)移載體

基因轉(zhuǎn)移載體主要有病毒載體和非病毒載體。

病毒載體主要利用病毒包膜蛋白的識別作用將外源基因轉(zhuǎn)到宿主細胞內(nèi)，主要包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、單純皰疹病毒(HSV)載體和慢病毒載體，相關(guān)病毒載體的比較可參見文獻[3]。病毒載體的主要缺點是存在自身免疫原性和可能造成細胞的病理改變等。①腺病毒(AV)載體與單鏈逆轉(zhuǎn)錄DNA病毒載體能高效地感染分裂和非分裂細胞。腺病毒載體能夠介導谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(GLT-1)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、鉀離子通道Kir2.1、β-內(nèi)啡肽、IL-2、IL-10和IL-24等，該載體經(jīng)鞘內(nèi)注射后主要感染腦膜細胞，這說明該載體可有其他的特異性靶細胞[4]。②腺病毒載體經(jīng)修飾后即為AAV，它的免疫原性比腺病毒低，不導致炎癥的發(fā)生或產(chǎn)生抗體。AAV有多種血清型，不同血清型的趨向性與注射的途徑有關(guān)，鞘內(nèi)注射能感染60%的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元，皮內(nèi)注射時感染率遠低于30%[5]。2009年Towne等報道將以AAV為載體且能表達針對電壓依賴性鈉離子通道Na(v)1.3的小發(fā)卡RNA的病毒注射入DRG可減輕保留神經(jīng)損傷(SNI)模型誘導的病理性疼痛。③HSV有兩條DNA鏈，有嗜神經(jīng)性，感染感覺神經(jīng)末梢后能逆向轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元胞體，從而減少給藥的次數(shù)和不良反應(yīng)，應(yīng)用前景良好[6]。HSV載體可介導腦啡肽原、γ-氨基丁酸、氨基脫羧酶和TNF-α，其中TNF-α是一種炎性因子，在神經(jīng)病理性疼痛調(diào)控中起重要作用。用HSV介導TNF-α能減輕大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛引起的疼痛行為。目前表達人的前腦啡肽原的HSV載體已應(yīng)用于臨床Ⅰ期試驗，將其接種在皮下可減輕癌癥引起的疼痛[7]。④慢病毒載體的優(yōu)點是能容納大片段的基因且免疫反應(yīng)小，而且能感染非分裂期的細胞。通過構(gòu)建攜帶含下游調(diào)控元件的拮抗分子(DREAM)基因短發(fā)夾干擾RNA的慢病毒載體，然后注入到坐骨神經(jīng)縮窄損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)慢病毒攜帶的短發(fā)夾干擾RNA能干擾脊髓中DREAM的表達, 說明此法可用于神經(jīng)病理性疼痛的治療。

非病毒載體因其諸多優(yōu)點而受到廣泛的關(guān)注。非病毒載體主要有細胞載體、脂質(zhì)體和質(zhì)粒等。①細胞載體具有取材和培養(yǎng)簡便、易轉(zhuǎn)染、高表達且無排斥等優(yōu)點，動物實驗中顯示有較好的鎮(zhèn)痛效果[8]。早期多使用腫瘤細胞，現(xiàn)在多使用神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)細胞和造血干細胞等。因宿主抗外源細胞免疫反應(yīng)，所以可采用生物材料將細胞微囊化，以降低免疫反應(yīng)的程度。②脂質(zhì)體主要包括中性、陰離子和陽離子脂質(zhì)體，因中性和陰離子脂質(zhì)體自身帶有很大的缺點，所以應(yīng)用受限。陽離子脂質(zhì)體自身帶有正電荷能夠與帶有負電荷的細胞膜進行融合，從而利用胞吞作用形成內(nèi)涵體的形式介導DNA進入到細胞內(nèi)。由于帶有正電荷，在血液循環(huán)中能與帶負電荷的血清蛋白吸附，形成聚集體而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，造成其血液循環(huán)時間短、轉(zhuǎn)染率低。針對此缺點，現(xiàn)已研發(fā)了基于可離子化陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體，稱為穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)粒子[9]。該粒子在血液中易與載脂蛋白結(jié)合，易被肝細胞吸收，具有很好的肝靶向[10]。Yu等[11]則合成了不同親水頭和疏水尾的可離子化陽離子脂質(zhì)用于小干擾RNA的傳遞，效果顯著。Tabernero等[12]的研究發(fā)現(xiàn)核酸-脂質(zhì)粒子能很好地抑制肝腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。③質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)簡單且易制備，無免疫反應(yīng)，也是一種常用的非病毒載體。

3.基因轉(zhuǎn)染的靶向性

基因轉(zhuǎn)染主要以神經(jīng)元和神經(jīng)元周邊的腦膜細胞為靶細胞。通過外周皮膚或黏膜注射及神經(jīng)核團定點注射的靶細胞為神經(jīng)元；通過腦脊液內(nèi)注射的靶細胞為神經(jīng)元周邊的腦膜細胞。以抗痛基因的過表達為靶點主要有：阿片肽前體、神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子等；以減少疼痛基因的表達為靶點主要有：蛋白激酶C、GTP環(huán)化水解酶1、NMDA受體和電壓依賴性鈉離子通道Na(v)1.3[6]。已有學者研究發(fā)現(xiàn)，在偏頭疼中樞敏感化過程中，蛋白激酶Cε膜轉(zhuǎn)位增加[13]。NMDA受體的2B亞基是參與疼痛調(diào)節(jié)的主要亞基，截肢前阻斷疼痛刺激能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)NMDA受體2B亞基的激活，阻止術(shù)后遷延性疼痛的發(fā)生[14]。

4.基因治療表達的調(diào)控

我們可以在不同水平調(diào)節(jié)基因治療，現(xiàn)有的研究多集中在動物模型中，臨床應(yīng)用研究還較少，需行進一步的探索研究。Wolfe等于2009年報道，他們在完善的臨床前期準備后將HSV基因載體用于治療頑固性癌痛患者，觀察其臨床鎮(zhèn)痛效果和不良反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)阻礙其臨床應(yīng)用的問題在于相關(guān)載體和基因產(chǎn)物的安全性，也應(yīng)注意如何提高其表達效率和血腦、血神經(jīng)屏障通過率。通過電針能增強慢性炎癥疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)牛腎上腺髓質(zhì)22肽的表達，并增強其非阿片受體(感覺神經(jīng)元特異性受體)和阿片受體(μ阿片受體、δ阿片受體)mRNA的表達[15]。

5.基因治療療效及安全性評價

療效的評價主要是在動物模型上體現(xiàn)的，現(xiàn)有的建立三叉神經(jīng)痛動物模型的方法主要有以下幾種：慢性縮窄環(huán)模型、三叉神經(jīng)末梢致痛模型、牙髓灌注模型、三叉神經(jīng)根埋植模型、經(jīng)顳下窩暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型、經(jīng)枕骨下暴露三叉神經(jīng)根模型和經(jīng)顳下暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型[16]。然后運用感覺測試器在不同的時間節(jié)點觀察動物模型的行為反應(yīng)和疼痛閾值的變化，以此來判斷基因治療的療效。

基因治療的安全性主要涉及到載體和基因產(chǎn)物兩方面。若為病毒載體往往具有一定的神經(jīng)毒性，AAV的毒性最小，而非病毒載體一般沒有毒性。基因的過度表達會造成神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂，過少又往往達不到預(yù)期的治療目的，因此關(guān)鍵還在于調(diào)控機制是否得當。

三、總結(jié)與展望

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛發(fā)病機制未明，雖有多種治療方法，仍不能達到理想效果，今后應(yīng)更深入地研究其機制，探索治療該病的更安全有效的療法，深入研究基因治療的可行性。治療應(yīng)采用個性化的治療方案，可結(jié)合多種療法。同時注重提高患者的生活質(zhì)量，加強患者的心理治療，消除抑郁、悲觀情緒，使其能更好地配合治療。隨著生物治療技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為藥物、手術(shù)、放射和中醫(yī)中藥治療之后的又一種治療手段，若有合適的載體和基因，在保證安全性的基礎(chǔ)上，基因治療將在原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的治療中發(fā)揮重要的作用。

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