si RNA沉默ST MN1對食管癌Eca-109細胞紫杉醇敏感性的影響＊

朱鴻武，江 丹，謝子英，周梅花，孫大勇，趙亞剛

（廣州軍區廣州總醫院消化內科，廣州510010）

食管癌是最為常見的腫瘤之一，在世界腫瘤疾病導致的死亡原因中位居第六［1］。中國是食管癌死亡率最高的國家之一，食管癌在中國癌癥所致的死亡原因中位居第四［2］。有研究報道，食管癌患者即使在嚴格的病例選擇和術前予以新輔助化療，聯合手術根除性治療后預后仍較差，5年存活率僅在20%左右［3］。因此，提高食管癌放化療有效性、通過多模態治療提高患者生存期和改善生存質量成為近年食管癌的研究熱點。導致化療失敗的一個最主要的原因就是食管癌細胞對化療藥物的原發性或繼發性耐藥。但是，目前食管癌的耐藥機制尚不清楚。因此，進一步研究并闡明食管癌的耐藥機制有助于為臨床提高食管癌患者的治療預后提供重要的理論依據。

紫杉醇是從美國短葉紅豆杉的樹皮中提取而來的一種物質，因其可以促進微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂周期阻滯在G2／M期，最終導致腫瘤細胞凋亡，因而具有很強的抗腫瘤作用，目前已被應用于包括食管癌在內的多種腫瘤化療之中［4］。但是，隨著臨床應用的增多，對紫杉醇耐藥的現象也在逐漸增多［4］。ST MN1是一種能夠在細胞的有絲分裂期和分裂間期改變微管動力學的微管脫穩定化磷蛋白［5］，在許多人類癌組織中表達增加，參與了細胞增殖、細胞運動、微管動力學調節和周期調節等功能［5］。近年來，有報道稱ST MN1在乳腺癌和骨肉瘤對紫杉醇的耐藥中發揮了關鍵的作用［6-8］，提示STMN1也是一個耐藥相關基因。ST MN1是否在食管癌對紫杉醇的耐藥中具有促進作用呢？目前尚無研究報道。本研究使用小干擾RNA（si RNA）在食管癌Eca-109細胞中沉默STMN1的表達，進而通過藥敏和凋亡等實驗觀察干預前、后食管癌細胞對紫杉醇的敏感性變化，初步探索沉默ST MN1對食管癌細胞紫杉醇敏感性的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 人食管癌Eca-109細胞購自中科院上海細胞庫；Trizol、LipofectamineTM2000和Opti-MEM?I購自Invertrogen公司；RIPA裂解液、5 X蛋白上樣緩沖液、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、PMSF、麗春紅染色液、MTT和結晶紫購自碧云天生物技術研究所；NC膜和ECL購自Millipore公司；RPMI-1640培養基和Hyclone胎牛血清購自Hyclone公司；紫杉醇購自美國施貴寶公司；Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所；STMN1 si RNA和scramble si RNA購自上海吉瑪制藥公司；逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自寶生物（大連）公司。anti-ST MN1一抗（＃3352）購自Cell Signaling公司；anti-β-actin一抗（sc-47778）購自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購自中杉金橋公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞培養 Eca-109細胞所用培養液為添加有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，除用于瞬時轉染的細胞在實驗前1周開始不使用抗菌藥物以外，所有培養液中已加入青霉素／鏈霉素。細胞培養于含5%CO2的37℃恒溫培養箱內。所有用于實驗的細胞均處于對數生長期。所有實驗均重復3次。

1．2．2 相關引物序列和q PCR 使用pub med BLAST工具和查閱文獻設計并合成相應的引物，ST MN1上游引物：5′-TAC ACT GCC TGT CGC TTG TC-3′，下 游 引 物：5′-GGG GAA AGG GGG AAT TCT GG-3′；GAPDH［9］：上 游 引 物5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′，下游引物：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′。采用Trizol氯仿法提取RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書配制反應體系并進行逆轉錄反應，按照實時定量PCR試劑盒說明書配制反應體系并進行實時定量PCR反應。

1．2．3 相關si RNA序列及轉染實驗 根據文獻［7］合成STMN1 si RNA，正義鏈：5′-GAA ACG AGA GCA CGA GAA A-3′，反 義 鏈：5′-UUU CUC GUG CUC UCG UUU C-3′；無 關si RNA，正義鏈：5′-GCA AAA GAG CGA AAA G-3′，反義鏈：5′-CUU UUC GCU CUU UUG C-3′。按LipofectamineTM2000說明書進行瞬時轉染步驟，轉染6 h以后更換培養液，72 h以后收取細胞進行相應的實驗。

1．2．4 Wester n blot實驗 胰酶消化并收集細胞，裂解液裂解并提取總蛋白，測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜并進行裁剪，用含5%脫脂牛奶的PBST封閉，一抗4℃孵育過夜；洗膜，二抗室溫孵育1 h；洗膜后加ECL溶液顯影觀察。

1．2．5 MTT藥敏實驗 胰酶消化收集細胞，按5×103／孔的密度接種于96孔培養板中，每孔培養液200μL，待細胞貼壁16 h；加入適當濃度梯度的紫杉醇進行體外藥物敏感性檢測，同時設置調零孔、對照孔，培養板置于培養箱中繼續孵育72 h；72 h以后先后加入MTT溶液和二甲基亞砜（DMSO），用酶標儀檢測吸光度并進行分析。

1．2．6 平板克隆形成實驗 胰酶消化收集細胞，按1×103／孔的密度接種于24孔培養板中，待細胞貼壁16 h后；加入0．04μmol／L的紫杉醇進行體外藥物敏感性檢測，每3 d更換培養液1次，共計培養14 d；14 d后，棄培養液，清洗、固定，0．5%結晶紫染色，數碼相機拍照后用Photoshop CS3軟件進行統計分析。

1．2．7 Hoechst 33258核染色實驗 胰酶消化收集細胞，按1×106／孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁16 h；加入0．1 μmol／L的紫杉醇，培養板置于培養箱中繼續孵育36 h誘導凋亡；36 h以后，按Hoechst試劑盒說明書染色、封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1．3 統計學處理 采用SPSS16．0統計軟件對實驗數據進行分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 轉染ST MN1 si RNA前、后Eca-109細胞ST MN1表達水平的變化 q PCR和Wester n blot檢測結果提示，轉染STMN1 si RNA 72 h以后，食管癌Eca-109細胞中的ST MN1的mRNA表達水平（圖1）和蛋白水平（圖2）均明顯下降。

圖1 轉染si RNA前、后食管癌Eca-109細胞中ST MN1 mRNA的表達變化（GAPDH作為內參基因）

圖2 轉染si RNA前、后食管癌Eca-109細胞中ST MN1蛋白的表達變化（β-actin作為內參）

2．2 MTT藥敏實驗結果提示沉默ST MN1可增加紫杉醇對Eca-109細胞的抑制率 MTT藥敏實驗結果顯示，采用特異性si RNA沉默ST MN1的表達后，食管癌Eca-109細胞相對于非特異si RNA轉染組的細胞，對紫杉醇的IC50值明顯下降（P＜0．01），提示對藥物敏感性增加（圖3）。

圖3 沉默ST MN1后Eca-109細胞對紫杉醇的敏感性

2．3 平板克隆形成實驗結果提示沉默ST MN1可增加Eca-109細胞對紫杉醇的敏感性 平板克隆形成實驗結果顯示，采用特異性si RNA沉默ST MN1的表達后，食管癌Eca-109細胞在0．04μmol／L紫杉醇的作用下平板克隆數目與非特異si RNA轉染組比較有明顯減少，見圖4。

圖4 沉默ST MN1后食管癌Eca-109細胞紫杉醇作用下克隆形成數目

2．4 沉默ST MN1后Eca-109在紫杉醇作用下凋亡增加 與空白對照組和無關si RNA轉染組相比，轉染了ST MN1特異性si RNA的Eca-109細胞在0．1μmol／L紫杉醇作用36 h以后，Hoechst 33258染料核染色顯示核濃染和碎裂的細胞明顯增多（圖5），提示凋亡細胞數目增加。

圖5 沉默ST MN1后食管癌Eca-109細胞在紫杉醇作用下凋亡增加（×400）

3 討 論

紫杉醇為紫杉烷類代表性的一種物質，目前已被廣泛應用于食管癌等多種惡性腫瘤的化療方案之中［4，10］。但是，紫杉醇也具有較強的不良反應，如過敏反應、脫發、骨髓抑制和周圍神經病等［11］，一定程度上影響了該藥的使用。近年來，紫杉醇在腫瘤治療中的原發性和繼發性耐藥問題逐漸受到重視。如何降低紫杉醇耐藥的發生，甚至在降低該藥的使用濃度亦能同樣達到有效殺傷腫瘤細胞的作用，對臨床食管癌患者的治療具有重要的意義。

ST MN1也被稱作stathmin 1、腫瘤蛋白18、metablasin、p18或p19，它由位于人染色體1p36．1的ST MN1基因編碼，是一種能夠在細胞有絲分裂期和分裂間期改變微管動力學的微管脫穩定化磷蛋白［5］。ST MN1在細胞正常生理中參與了有絲分裂中微管的調節，但是，在腫瘤細胞中常常發生因為ST MN1失調而導致有絲分裂紡錘體功能減退和導致對紫杉醇的耐藥［12］。近年來亦有研究報道ST MN1可促進乳腺癌和骨肉瘤對紫杉醇的耐藥［6-8］。因此，推測ST MN1很可能也參與了食管癌細胞對紫杉醇的耐藥。

本研究通過脂質體轉染法將ST MN1 si RNA瞬時轉染入食管癌Eca-109細胞中，q PCR和Wester n blot提示基因干擾效果確切，轉染后ST MN1無論是mRNA水平還是蛋白水平均有明顯下降。進一步在細胞藥敏實驗中發現，沉默ST MN1的表達后食管癌Eca-109細胞對紫杉醇的化療敏感性明顯增強。由此推測，在有效沉默ST MN1的表達后，即使降低紫杉醇的藥物濃度亦可以同樣有效地殺傷食管腫瘤細胞，因此有助于臨床中降低化療藥物用量，減少不良反應的發生和提高治療有效性。在細胞凋亡實驗的檢測中，發現沉默ST MN1的表達后，食管癌Eca-109細胞在紫杉醇作用下凋亡也明顯增加，提示ST MN1導致的耐藥機制之一可能為減少食管癌細胞在紫杉醇作用下的凋亡。

綜上所述，ST MN1在食管癌對紫杉醇的化療敏感性中發揮了關鍵的作用，通過si RNA有效沉默ST MN1的表達有助于增強食管癌對紫杉醇化療的敏感性并導致食管癌細胞化療下凋亡的增加。本研究結果有助于進一步闡明食管癌對紫杉醇耐藥的機制，亦可能有助于為臨床中減少紫杉醇類藥物不良反應和降低化療耐藥的發生提供理論依據。

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